El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo. Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.
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Artículo de método
A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)
En este artículo
Resumen
Resumen
El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo. El enfoque ofrece un análisis imparcial y en profundidad que puede permitir el desarrollo de pruebas diagnósticas, terapias novedosas y una mayor comprensión de los procesos de la enfermedad. La diversidad química inherente al metaboloma crea importantes desafíos analíticos y no existe un único enfoque experimental que pueda detectar todos los metabolitos. Además, la variación biológica en el metabolismo individual y la dependencia del metabolismo de los factores ambientales requiere un gran número de muestras para lograr la potencia estadística adecuada requerida para una interpretación biológica significativa. Para abordar estos desafíos, este tutorial describe un flujo de trabajo analítico para el perfil de metabolitos no dirigidos a gran escala del suero mediante UPLC-MS. El procedimiento incluye directrices para la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos, y permitirá la adquisición fiable de datos para grandes experimentos y proporcionará un punto de partida para los laboratorios nuevos en la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos por UPLC-MS.
Introducción
El término "metabolómica" puede abarcar muchas cosas. Por ejemplo, un experimento metabolómico se puede realizar utilizando una variedad de plataformas analíticas como la RMN y la cromatografía de gases y/o líquidos junto con la espectrometría de masas. Además, los experimentos metabolómicos se pueden realizar de manera dirigida o no dirigida, o una combinación de ambas. Un experimento metabolómico dirigido implicará el análisis dirigido de un panel de moléculas importantes para la cuestión biológica en cuestión (por ejemplo, las moléculas pequeñas involucradas en el ciclo del TCA permitirán una cuantificación precisa de esa vía). En esta situación, la hipótesis biológica dicta la elección de los metabolitos a los que se dirigirá el análisis y se optimizan los pasos analíticos para la detección de estas moléculas. Alternativamente, un experimento de metabolómica no dirigida genera hipótesis. En este caso, el experimento se realiza de manera amplia e imparcial para permitir la detección de tantos metabolitos como sea posible. Los resultados de un experimento no dirigido impulsarán el siguiente paso de la investigación (que en muchos casos puede implicar un flujo de trabajo de metabolómica dirigido). También es posible combinar los dos enfoques, en cuyo caso un experimento se realiza de manera no dirigida mientras que al mismo tiempo se monitorea un panel de moléculas conocidas dentro de los datos.
El tutorial presentado aquí se centra específicamente en el perfil de metabolitos no dirigidos del suero. Como se ha descrito anteriormente, el enfoque no dirigido proporciona una visión imparcial de los metabolitos detectables, puede generar grandes cantidades de información y, en última instancia, permitir nuevos descubrimientos. El uso de este enfoque, específicamente el empleo de cromatografía líquida de ultra rendimiento acoplada a espectrometría de masas (UPLC-MS), se está generalizando 1, 2, 3 e implica los siguientes pasos: (1) diseño experimental (2) recolección de muestras (3) preparación de muestras (4) adquisición de datos por UPLC-MS (5) preprocesamiento de datos (detección de picos, integración, alineación y normalización) (6) análisis estadístico de datos (tanto uni como multivariado) (7) identificación de metabolitos y (8) biológico interpretación.
Actualmente, no existen métodos estándar establecidos para el perfil de metabolitos no dirigidos basado en UPLC-MS y los posteriores pasos de preprocesamiento de datos. Esta falta de estandarización se debe en parte a uno de los principales desafíos analíticos de la elaboración de perfiles de metabolitos; la diversidad química del metaboloma. Debido a esta diversidad, es imposible que un solo método de extracción o método de adquisición por espectrometría de masas proporcione una cobertura completa de todos los metabolitos en un solo análisis. En concepto, la cobertura de metabolitos se puede maximizar mediante el uso de múltiples extracciones (por ejemplo, acuosas, metanol, cloroformo:metanol, etc.) junto con diversas condiciones cromatográficas (por ejemplo, fase inversa, HILIC, etc.) y varios modos de ionización (por ejemplo, iones positivos, iones negativos, ionización química, etc.).). A menudo, sin embargo, los investigadores no tienen un sesgo predeterminado para una clase química específica y, por lo tanto, el costo de realizar múltiples extracciones y adquisiciones de instrumentos no está justificado, especialmente para experimentos a gran escala. Por lo tanto, el video tutorial presentado aquí fue diseñado para proporcionar un procedimiento general para el perfil de metabolitos no dirigidos a gran escala del suero por UPLC-MS. Permitirá a los laboratorios nuevos y establecidos realizar este tipo de experimentos y los componentes básicos sobre los que pueden ampliar el enfoque para varios tipos de muestras, clases químicas específicas o análisis específicos. Específicamente, este protocolo incluirá los pasos de: preparación de muestras de suero, organización de muestras para estudios a gran escala, adquisición de datos UPLC-MS, procedimientos de control de calidad (QC) e identificación de metabolitos. También se presentan estrategias para el preprocesamiento de datos y el análisis estadístico.
El protocolo no se centrará en los pasos del diseño experimental, la recolección de muestras o la interpretación de datos biológicos, ya que está fuera del alcance de este tutorial. Sin embargo, existen muchos recursos en la literatura para estos temas y los autores animan a los investigadores nuevos en metabolómica a explorarlos a fondo 4, 5, 6, 7, 8, 9. En particular, el diseño experimental es extremadamente importante y es crítico para el éxito de un experimento metabolómico no dirigido. Deben tenerse en cuenta factores como la replicación biológica adecuada y la coherencia del procedimiento de recogida de muestras (por ejemplo, el tiempo en el laboratorio, la temperatura de almacenamiento, el tiempo de almacenamiento, la congelación y descongelación, etc.) para garantizar un estudio viable y facilitar la interpretación biológica adecuada de los datos.
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Protocolo
1. Ejemplo de organización
- Para crear un mapa de placas para la preparación de muestras en una hoja de cálculo, en la primera columna introduzca una lista de muestras en orden de carga. En una segunda columna, introduzca las 96 ubicaciones de las placas de pocillos utilizando la nomenclatura correcta para el software de su muestreador automático.
- Guarde un pocillo en cada placa para muestras de control de calidad.
- Si su muestreador automático LC puede manejar dos placas a la vez, separe la lista de muestras en lotes de 190 y guarde esta información en una segunda hoja de trabajo.
- Dentro de cada uno de estos lotes, use la función de aleatorización [nota: "=rand()"en Excel] para aleatorizar el orden de inyección. Ahora copie y pegue su orden de inyección en el sistema de software de cola de muestras LC-MS. La aleatorización debe producirse entre lotes, dentro de lotes y ser única en todas las réplicas de inyección.
2. Procedimientos de preparación de muestras de suero y control de calidad (QC)
- Prepare un stock de 10 ml de muestra de control de calidad que contenga un mínimo de cuatro compuestos de masa conocida y tiempo de retención que abarquen la elución cromatográfica del experimento. (Nota: cafeína, reserpina, sulfadimetoxina y terfenadina a una concentración de 2 μg/ml cada uno).
- Descongele las muestras de suero en hielo y en un vórtice suave durante ~ 5 segundos.
- Humedezca previamente las puntas de una pipeta de 12 canales con metanol para ayudar a evitar el goteo de la punta durante la dispensación de la muestra. A continuación, añada 370 μl de metanol frío a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Transfiera 100 μl de cada muestra a la ubicación de la placa correspondiente desde los mapas de placas. Cubrir las placas e incubar a -80 °C durante 30 min para precipitar las proteínas.
- Centrifugar las placas en una centrífuga a 4 °C a 3.200 x g durante 30 min. Transfiera 250 μl de sobrenadante a un nuevo pocillo de 96 pocillos y repita la centrifugación.
- Ahora transfiera 60 μl de alícuotas del sobrenadante a tres placas de 96 pocillos adecuadas para el muestreador automático UPLC o LC.
- Agregue 100 μl de mezcla de muestra de control de calidad a la posición de pocillo reservada en la placa.
- Selle cada placa con una película adhesiva. El solvente puede evaporarse rápidamente después de perforar el pozo y, por lo tanto, las inyecciones solo deben realizarse una vez desde cada placa. Las placas de la cola de muestras pueden almacenarse a corto plazo a -20 °C.
3. Adquisición de datos UPLC-MS
- Ajuste el muestreador automático a 4 °C y coloque las dos primeras placas en el muestreador automático.
- Configure el método de adquisición utilizando uno de los dos gradientes de fase inversa alternativos. El gradiente A está sesgado hacia moléculas no polares, mientras que el gradiente B proporcionará una cobertura mejorada de moléculas moderadamente polares.
- Gradiente A:
Tiempo (min) %A %B curva 0.0 100 0 0.1 100 0 6 1.0 60 40 6 3.0 30 70 6 11.0 0 100 6 17.0 0 100 6 Artículo 17.1 100 0 6 23.0 100 0 6 - Gradiente B
Tiempo (min) %A %B curva 0.0 100 0 1 100 0 6 13 5 95 6 16 5 95 6 16.05 100 0 6 20 100 0 6
- Gradiente A:
- Configure el espectrómetro de masas para recopilar datos en modo positivo de escaneo de 50 a 1.200 m/z. Las condiciones específicas adicionales del instrumento variarán según el sistema utilizado. Las siguientes representan las condiciones de uso en nuestro espectrómetro de masas Xevo G2 Q-TOF de Waters: Energía de colisión = 6V; Tiempo de escaneo = 0,2 segundos por escaneo; Voltaje capilar =2.200 V; Temperatura de la fuente = 150 °C, temperatura de dessolvatación = 350 °C, flujo de gas de dessolación (N2) = 800 L/hr).
- Inyecte las muestras de control de calidad cinco veces al comienzo de cada lote de muestras de 2 placas. Después de acondicionar el sistema UPLC-MS con las dos primeras inyecciones, controle el área máxima (<25% RSD), el tiempo de retención (+/- 0,05 min) y la precisión de la masa (+/- 3 ppm) de la tercera a la quinta inyección. Es posible que sea necesario ajustar estos parámetros para que se ajusten a las especificaciones del instrumento que se utiliza para la adquisición de datos.
- Si las muestras de control de calidad pasan, adquiera datos sobre muestras de suero para esas dos placas. Si se produce un error en las muestras de control de calidad, los datos de muestra no se recopilan hasta que se resuelve el problema y se aprueban las muestras de control de calidad. En nuestro laboratorio hemos comprobado que estos parámetros son consistentemente estables durante tres días de inyecciones (es decir, la inyección de 2 placas de 96 pocillos). Si se encuentra que su sistema es inestable durante este período de tiempo, pueden ser apropiadas inyecciones de control de calidad más frecuentes. La muestra de control de calidad no se utiliza para corregir datos de mala calidad, sino para evitar que se recopilen datos de mala calidad.
4. Detección, integración, alineación y normalización de picos
Hay una variedad de opciones para realizar estos pasos, incluyendo software gratuito y herramientas específicas del proveedor. Este paso se ha omitido en el video tutorial, pero nuestro enfoque se describe a continuación como ejemplo.
Para cada muestra, los datos analíticos generados a partir de este tipo de experimento son un perfil de iones descrito por un tiempo de retención, un valor m/z y una intensidad espectral. Un experimento de perfil de metabolitos no dirigido se compondrá de muchas muestras y, por lo tanto, se deben realizar la detección de picos, la alineación del tiempo de retención y la normalización para permitir el análisis estadístico posterior del conjunto de datos.
- Exporte datos sin procesar a formato .cdf con el software DataBridge de Waters. Realice la detección de picos y la alineación del tiempo de retención utilizando el paquete de software XCMS 10 (software gratuito disponible en http://metlin.scripps.edu/xcms/) y se ejecuta en el entorno estadístico R11). El sitio web contiene documentación sobre cómo descargar y ejecutar el software.
- Utilice el método "matchedfilter" dentro de XCMS con los siguientes parámetros: ancho completo a medio máximo = 8 segundos, relación S/N = 3, máximo de 100 picos para cada cromatograma iónico extraído. Realice los pasos de agrupación de características, corrección del tiempo de retención, reagrupamiento y fillPeaks. La salida del software XCMS es una matriz de datos con todas las características detectables enumeradas como filas, cada muestra experimental como una columna y las celdas se rellenan con el área máxima de cada característica en cada muestra. La transposición de este conjunto de datos puede ser necesaria para su incorporación a los flujos de trabajo estadísticos posteriores.
- Normalice la matriz de datos en R dividiendo el área de pico de cada característica en una muestra dada por la suma del área de pico de iones extraídos (conocida como corriente de iones total, o TIC para esa muestra (multiplicada por 100,000 para que los números sean más susceptibles para la interpretación visual de datos).
- Elimine los valores atípicos. Los valores atípicos en los datos pueden ser el resultado de una mala inyección de una buena muestra o de una buena inyección de una mala muestra.
- Realice la detección de valores atípicos en R utilizando el paquete de valores atípicos con los siguientes parámetros: (1) valores TIC y (2) puntuaciones PC con un 99,9 % de confianza.
- Si hay valores atípicos, se eliminan los archivos de datos correspondientes y se vuelven a realizar los procedimientos de detección, alineación y normalización de picos.
- Promedie las áreas de pico normalizadas por identificador de muestra (para promediar varias inyecciones). Esto debe hacerse antes de realizar el análisis estadístico (tenga en cuenta que las réplicas de inyección tienen en cuenta la variación analítica, pero no se pueden usar como réplicas biológicas verdaderas).
5. Análisis estadístico
Para los experimentos de metabolómica, se necesitan técnicas estadísticas multivariadas y univariadas para la interpretación de los datos. Dos técnicas que se utilizan comúnmente incluyen el Análisis de Componentes Principales y el Análisis de Varianza (ANOVA). Hay múltiples formas de abordar el análisis estadístico de los datos y existen herramientas de software comerciales y de código abierto. Este paso se ha omitido en el video tutorial, pero nuestro enfoque se describe a continuación como ejemplo.
- Realice ANOVA aplicando una función aov al conjunto de datos en R.
- Tenga en cuenta los falsos positivos utilizando un ajuste de Benjamini-Hochberg (función p.adjust en R).
- Realice PCA con el conjunto de datos a escala de Pareto (también se puede aplicar la varianza unitaria) y centrado en la media. Tanto las puntuaciones como las cargas de PC se calculan utilizando el paquete pcaMethods en R.
- Utilice los valores p de ANOVA, las puntuaciones de carga y los parámetros de cambio de pliegue para determinar las características moleculares que mejor describen la variación asociada con el tratamiento experimental.
- Interrogue manualmente cada característica molecular de interés para determinar si corresponde a un ion molecular, un aducto (por ejemplo, sodio, potasio o dímero) o una pérdida neutra.
6. Identificación de metabolitos
El flujo de trabajo presentado aquí es muy general y se puede aplicar a los resultados de cualquier plataforma de instrumentos. Una estrategia alternativa se presenta en la sección de Discusión.
- Para todas las características estadísticamente significativas (según lo determinado a partir del análisis en el paso 6), revise los datos sin procesar y confirme que los iones principales, los aductos de sodio, los isótopos y los fragmentos siguen tendencias similares en todo el conjunto de datos. Por ejemplo, el valor p derivado de ANOVA para un ion padre debe ser similar a su isótopo. Esto indica que ambas características moleculares corresponden al mismo metabolito.
- Busque mediciones de masa precisas y/o pérdidas neutras de características moleculares estadísticamente significativas (elija isótopo C12 si hay varios isótopos significativos) en bases de datos de metabolitos internas (si están disponibles) o disponibles públicamente, tales como:
- Base de datos del metaboloma humano (http://www.hmdb.ca/)
- Metlin (http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php)
- Banco masivo (http://www.massbank.jp/?lang=en)
- Mapas de lípidos (http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html)
- Instituto Nacional de Estándares y Tecnología MS Search (http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/)
- Utilice software para predecir una fórmula molecular a partir de la masa precisa y la distribución isotópica de sus características moleculares significativas. En el software Waters, esto se realiza utilizando la herramienta Elemental Comp en el paquete MassLynx.
- Filtre las identificaciones de metabolitos candidatos por: error de masa (según corresponda a la plataforma de su instrumento), fórmula molecular predicha, relevancia biológica en las tendencias observadas con respecto al diseño experimental y tiempo de retención (por ejemplo, los lípidos y otros compuestos no polares tendrán tiempos de retención más largos cuando se emplee cromatografía de fase inversa).
- Realizar experimentos posteriores para adquirir la fragmentación MS/MS para características moleculares estadísticamente significativas. Siempre que sea posible, la identificación de metabolitos debe basarse en la coincidencia de los picos de fragmentación experimental y el tiempo de retención con los de un patrón auténtico adquirido en el mismo instrumento. Alternativamente, la fragmentación experimental se puede hacer coincidir con una base de datos espectral.
- La confianza en la identificación debe asignarse a todas las identificaciones de metabolitos notificadas sobre la base de las recomendaciones12.
de la iniciativa de normas metabolómicas Nivel 1: identificación molecular fiable basada en parámetros analíticos ortogonales (masa precisa, tiempo de retención y fragmentación MS/MS) en relación con un compuesto auténtico.
El nivel 2 se refiere a una identificación putativa basada en propiedades fisicoquímicas y/o similitud espectral con la literatura o bibliotecas espectrales.
El nivel 3 se refiere a la identificación putativa de una clase de compuestos basada en propiedades fisicoquímicas o similitud espectral.
El nivel 4 se refiere a un compuesto desconocido.
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Resultados
Los pasos analíticos básicos de un experimento de perfilado de metabolitos no dirigido mediante UPLC-MS se ilustran en la Figura 1. Los datos brutos de cada muestra pueden visualizarse como un cromatograma de pico base. La Figura 2 muestra un ejemplo de cromatograma de pico base de una muestra de suero analizada mediante la opción de gradiente (a) del tutorial. Tras el análisis estadístico descrito anteriormente, se intenta la identificación de metabolitos para todas las características ...
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Discusión
Este tutorial está destinado a servir como punto de partida para realizar perfiles de metabolitos no dirigidos a gran escala mediante UPLC-MS. El flujo de trabajo se centra en los metabolitos que pueden extraerse con un disolvente de metanol acuoso, retenerse en una columna UPLC C8 o C18 y detectarse como iones positivos. En la situación en la que no existe un sesgo predeterminado hacia una clase específica de metabolitos y se desea una hipótesis que genere un perfil global, este protocolo es valioso ya que dará como res...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
El tutorial presentado se realizó y desarrolló dentro de la Instalación de Proteómica y Metabolómica de la Universidad Estatal de Colorado, que está parcialmente financiada por los Recursos de la Administración de Investigación para Proyectos Académicos de CSU.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 96 pocillos - 500 μ l pocillos | VWR | 40002-020 | Estos se utilizan para la preparación de muestras |
| 96 pocillos esteras VWR | 89026-514 | Estos se utilizan para la preparación de muestras | |
| 96 pocillos placas - 350 μ l pozos | Waters Corporation | WAT058943 | Estos se utilizan para la inyección |
| de muestras Esteras de placa de 96 pocillos | Waters Corporation | 186000857 | Estos se utilizan para la inyección |
| de muestras Sellos térmicos de placa de 96 pocillos | Waters Corporation 186002789 | Estos se pueden utilizar para la inyección de muestras o el almacenamiento a largo plazo | |
| Sellador térmico de placa de 96 pocillos | Waters Corporation | 186002786 | |
| Metanol de grado LC-MS | Fluka | 34966 | |
| Acetonitrilo de grado LC-MS | Fluka | 34967 | |
| fórmico de grado LC-MS | Fluka | ||
| Pipeta electrónica multicanal | VWR | 89000-674 | |
| B-5061/B-4061 | |||
| Centrífuga refrigerada - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - contacto Beckman Coulter | |
| Sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) Acquity | Waters Corporation | N/A - contacto Waters Corporation | |
| Columna UPLC C8 (opción de gradiente a) | Waters Corporation | 186002876 | |
| Columna UplC T3 (opción de gradiente b) | Aguas Corporation | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF Espectrómetro de masas | Waters Corporation | N/A - contacto Waters Corporation |
Referencias
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