El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo. Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.
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Artículo de método
A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)
En este artículo
Resumen
Resumen
El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo. El enfoque ofrece un análisis imparcial y en profundidad que puede permitir el desarrollo de pruebas diagnósticas, terapias novedosas y una mayor comprensión de los procesos de la enfermedad. La diversidad química inherente al metaboloma crea importantes desafíos analíticos y no existe un único enfoque experimental que pueda detectar todos los metabolitos. Además, la variación biológica en el metabolismo individual y la dependencia del metabolismo de los factores ambientales requiere un gran número de muestras para lograr la potencia estadística adecuada requerida para una interpretación biológica significativa. Para abordar estos desafíos, este tutorial describe un flujo de trabajo analítico para el perfil de metabolitos no dirigidos a gran escala del suero mediante UPLC-MS. El procedimiento incluye directrices para la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos, y permitirá la adquisición fiable de datos para grandes experimentos y proporcionará un punto de partida para los laboratorios nuevos en la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos por UPLC-MS.
Introducción
El término "metabolómica" puede abarcar muchas cosas. Por ejemplo, un experimento metabolómico se puede realizar utilizando una variedad de plataformas analíticas como la RMN y la cromatografía de gases y/o líquidos junto con la espectrometría de masas. Además, los experimentos metabolómicos se pueden realizar de manera dirigida o no dirigida, o una combinación de ambas. Un experimento metabolómico dirigido implicará el análisis dirigido de un panel de moléculas importantes para la cuestión biológica en cuestión (por ejemplo, las moléculas pequeñas involucradas en el ciclo del TCA permitirán una cuantificación precisa de esa vía). En esta situación, la hi....
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Protocolo
1. Ejemplo de organización
- Para crear un mapa de placas para la preparación de muestras en una hoja de cálculo, en la primera columna introduzca una lista de muestras en orden de carga. En una segunda columna, introduzca las 96 ubicaciones de las placas de pocillos utilizando la nomenclatura correcta para el software de su muestreador automático.
- Guarde un pocillo en cada placa para muestras de control de calidad.
- Si su muestreador automático LC puede manejar dos placas a la vez, separe la lista de muestras en lotes de 190 y guarde esta información en una segunda hoja de trabajo.
- Dentro de cada uno de estos lotes, use la funci....
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Resultados
Los pasos analíticos básicos de un experimento de perfilado de metabolitos no dirigido mediante UPLC-MS se ilustran en la Figura 1. Los datos brutos de cada muestra pueden visualizarse como un cromatograma de pico base. La Figura 2 muestra un ejemplo de cromatograma de pico base de una muestra de suero analizada mediante la opción de gradiente (a) del tutorial. Tras el análisis estadístico descrito anteriormente, se intenta la identificación de metabolitos para todas las características .......
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Discusión
Este tutorial está destinado a servir como punto de partida para realizar perfiles de metabolitos no dirigidos a gran escala mediante UPLC-MS. El flujo de trabajo se centra en los metabolitos que pueden extraerse con un disolvente de metanol acuoso, retenerse en una columna UPLC C8 o C18 y detectarse como iones positivos. En la situación en la que no existe un sesgo predeterminado hacia una clase específica de metabolitos y se desea una hipótesis que genere un perfil global, este protocolo es valioso ya que dará como res.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
El tutorial presentado se realizó y desarrolló dentro de la Instalación de Proteómica y Metabolómica de la Universidad Estatal de Colorado, que está parcialmente financiada por los Recursos de la Administración de Investigación para Proyectos Académicos de CSU.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 96 pocillos - 500 μ l pocillos | VWR | 40002-020 | Estos se utilizan para la preparación de muestras |
| 96 pocillos esteras VWR | 89026-514 | Estos se utilizan para la preparación de muestras | |
| 96 pocillos placas - 350 μ l pozos | Waters Corporation | WAT058943 | Estos se utilizan para la inyección |
| de muestras Esteras de placa de 96 pocillos | Waters Corporation | 186000857 | Estos se utilizan para la inyección |
| de muestras Sellos térmicos de placa de 96 pocillos | Waters Corporation 186002789 | Estos se pueden utilizar para la inyección de muestras o el almacenamiento a largo plazo | |
| Sellador térmico de placa de 96 pocillos | Waters Corporation | 186002786 | |
| Metanol de grado LC-MS | Fluka | 34966 | |
| Acetonitrilo de grado LC-MS | Fluka | 34967 | |
| fórmico de grado LC-MS | Fluka | ||
| Pipeta electrónica multicanal | VWR | 89000-674 | |
| B-5061/B-4061 | |||
| Centrífuga refrigerada - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - contacto Beckman Coulter | |
| Sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) Acquity | Waters Corporation | N/A - contacto Waters Corporation | |
| Columna UPLC C8 (opción de gradiente a) | Waters Corporation | 186002876 | |
| Columna UplC T3 (opción de gradiente b) | Aguas Corporation | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF Espectrómetro de masas | Waters Corporation | N/A - contacto Waters Corporation |
Referencias
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al.
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Reimpresiones y permisos
