ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Summary

De alto rendimiento selectiva 2 'acilación hidroxilo analizados por extensión del cebador (FORMA) utiliza un software de predicción de estructura secundaria de producto químico nuevo sondeo de la tecnología, la transcripción inversa, electroforesis capilar y para determinar las estructuras de ARN de varios cientos a varios miles de nucleótidos en una sola resolución de nucleótidos.

Abstract

Comprender la función del ARN que participan en los procesos biológicos exige un conocimiento profundo de la estructura del ARN. Con este fin, la metodología denominada "acilación hidroxilo de alto rendimiento 2 selectivo 'analizado mediante extensión de cebador", o forma, permite la predicción de la estructura secundaria de ARN con una sola resolución de nucleótidos. Este enfoque utiliza agentes químicos de sondeo que preferentemente acilato de regiones de cadena sencilla o flexible de ARN en solución acuosa. Sitios de modificación química se detectan mediante transcripción inversa del ARN modificado, y los productos de esta reacción son fraccionados por electroforesis capilar automatizado (CE). Dado que la transcriptasa inversa se detiene en esos nucleótidos de ARN modificados por los reactivos de la forma, la biblioteca de cDNA resultante asigna indirectamente estos ribonucleótidos que son de cadena sencilla en el contexto de los ARN plegadas. El uso de software ShapeFinder, los producidos por electroferogramas automatizado CE son procesados ​​y convertidos en nutablas de reactividad cleotide que se convierten ellos mismos en las limitaciones del pseudo-energía utilizadas en el RNAStructure (v5.3) algoritmo de predicción. Las estructuras de ARN de dos dimensiones obtenidos por combinación de una forma sondeo con ARN in silico de predicción de estructura secundaria se han encontrado para ser mucho más precisa que la estructuras obtenidas usando cualquier método solo.

Introduction

Para comprender las funciones de los ARN catalíticos y no codificantes implicadas en la regulación del corte y empalme, traducción, replicación del virus y el cáncer, se requiere un conocimiento detallado de la estructura del ARN ^1,2. Desafortunadamente, la predicción exacta de ARN plegado presenta un reto formidable. Agentes de sondeo clásicas sufren de muchas desventajas tales como la toxicidad, la cobertura incompleta de nucleótidos y / o un caudal limitado a 100-150 nucleótidos por experimento. Algoritmos de predicción de estructura secundaria sin ayuda son igualmente desventajoso, debido a las inexactitudes que resultan de su incapacidad para distingu....

Protocol

Diseño de cebadores y extensión de la terminal del ARN 3 '

Para el análisis de ARN de largo por FORMA de alto rendimiento, una serie de sitios de hibridación de cebadores debe ser seleccionado de tal manera que (i) están separados por ~ 300 nt, (ii) son 20-30 nt de longitud, y (iii) que el ARN / híbridos de ADN producidos por el recocido de ADN a estos sitios tienen una temperatura de fusión esperada de> 50 ° C. Además, los segmentos de ARN que se predicen para ser altamente estructurado se deben evitar, a pesar de hacer tal determinación requiere algo de conocimiento previo de la estructura de ARN, que es a menudo no está disponible. Cebado....

Results

ARN que contiene el VIH-1 elemento de respuesta rev (RRE) y un 3 'casete estructura de la terminal ⁴ se preparó a partir de un plásmido linealizado por la transcripción in vitro, después de lo cual se pliega por calentamiento, enfriamiento, y la incubación a 37 ° C en la presencia de MgCl _2. ARN fue expuesto a NMIA y luego a transcripción inversa a partir de un cebador de ADN 5'-marcado en el extremo hibridó con el casete de estructura de la terminal 3 '. La forma biblioteca de cD.......

Discussion

Se presenta aquí un protocolo detallado para la forma de alto rendimiento, una técnica que permite la determinación de la estructura secundaria de la resolución de un solo nucleótido de ARN de cualquier tamaño. Por otra parte, el acoplamiento de datos experimentales forma con algoritmos de predicción de estructura secundaria facilita la generación de modelos de ARN 2D con un mayor grado de precisión que es posible con cualquiera de los métodos solos. La combinación de cebadores marcados con fluorescencia y automatizado .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-metilisatoico fuerte (NMIA)	Life technologies	M25	Disolver en
anhídrido DMSO 1-metil-t-nitroisatoico anhidro (1M7)	ver ref. 22
Superíndice III Transcriptasa inversa	technologies	18080044	10.000 unidades
Kit de secuenciación de ciclo termosecuenciasa	Affymetrix	78500
Materiales proporcionados por el usuario
fuerte de interés			6 pmol por reacción (el límite de detección será determinado por el instrumento)
Sets de cuatro cebadores marcados de 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 y WellRed D1/Licor IR800)			Los cebadores son complementarios al ARN y se utilizan en reacciones de transcripción inversa y secuenciación. Los fluoróforos enumerados son óptimos para el Beckman Coulter 8000 CEQ. Los cebadores se pueden comprar o sintetizar en casa.
El ADN molde			utiliza para secuenciar las reacciones y debe contener la secuencia del ARN que se está estudiando, incluida cualquier extensión 3'terminal, si está presente. Cuando corresponda, a menudo es conveniente utilizar la plantilla de transcripción de ARN.
tampones
10x tampón			100 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X tampón			200 mM Tris-HCl pH 8,0, 25 mM MgCl><2, 2,5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Este tampón puede modificarse según el caso (p. ej. pH, EDTA, Mg, inhibidor de RNasa)
2.5X RT mix			4 μ l Tampón 5X, 1 μ l 100 mM TDT, 1,5 y mu; l agua,1 μ l 10 mM dNTPs, 0.5 μ l SuperScript III. Tenga en cuenta que el búfer 5X y el TDT de 100 mM se proporcionan con la compra de SuperScript III (Invitrogen).
Solución de carga de muestras de GenomeLab (Beckman Coulter)			Atención: Evite múltiples ciclos
EQUIPMENT
Electroforesis capilar	Beckman	CEQ8000
Thermocycler	varía