La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

Resumen

Un protocolo para la separación de ectodermo y el mesénquima facial embrión se describe. Utilizamos Dispasa II para el tratamiento de embriones enteros en primer lugar, analizar las prominencias faciales completas, y luego separar el ectodermo facial y mesénquima.

Resumen

Hendiduras orofaciales son los defectos craneofaciales más frecuentes, que afectan a 1,5 de cada 1.000 recién nacidos en todo el mundo ^1,2. Hendidura orofacial es causada por el desarrollo facial anormal ^3. En, humanos y de ratón de crecimiento inicial y el patrón de la cara se basa en varios brotes pequeños de tejido, las prominencias ^4,5 faciales. La cara se deriva de seis pares de prominencias frontales principales: procesos nasales (FNP), prominencias maxilares (MXP) y prominencias mandibulares (MdP). Estas protuberancias consisten en hinchazones de mesénquima que se encajonan en un epitelio suprayacente. Los estudios en múltiples especies han mostrado que la señalización a la diafonía entre el ectodermo y el mesénquima facial es crítica para dar forma a la cara ^6. Sin embargo, los detalles mecanicistas sobre los genes implicados en estos relés de señalización son insuficientes. Una forma de obtener una comprensión completa de la expresión génica, factor de transcripción de unión, y las marcas asociadas a la cromatina con el desarrollo de ciertasmesa de ping ectodermo y el mesénquima facial es aislar y caracterizar los compartimentos de tejido separados.

Aquí presentamos un método para separar ectodermo y el mesénquima facial en el día embrionario (E) 10,5, una etapa crítica en el desarrollo en la formación de ratón facial que precede a la fusión de las prominencias. Nuestro método es una adaptación del enfoque que hemos utilizado anteriormente para disecar las prominencias faciales ^7. En este estudio anterior que había empleado C57BL consanguínea / 6 ratones como esta variedad se ha convertido en un estándar para la genética, la genómica y la morfología facial ^8. Aquí, sin embargo, debido a las cantidades más limitadas de tejido disponible, hemos utilizado el outbred cepa CD-1 que es más barato para comprar, más robusto para la cría, y que tiende a producir más embriones (12-18) por camada que cualquier endogámica ratón cepa ^8. Después del aislamiento del embrión, proteasa neutra dispasa II se utiliza para tratar el embrión. Entonces, las prominencias faciales fueron diseccionared a cabo, y el ectodermo facial se separó a partir del mesénquima. Este método evita que tanto el ectodermo y el mesénquima facial intacto. Las muestras obtenidas utilizando esta metodología se puede utilizar para técnicas que incluyen la detección de proteínas, la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de ensayo, los estudios de microarrays, ARN y ss-.

Protocolo

1. Preparar Dispasa II

1. Preparar fresco Hepes-solución salina tamponada (HBS) (50 mM HEPES / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Añadir 2 ml de 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 y 1,2 ml de NaCl 2,5 M en 16,8 ml ultrapura H ₂ O.
2. Hacer 10 mg / ml Dispasa II. Pesar 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) y disolver en 20 ml de HBS. Preparar alícuotas de 1,0 ml en tubos individuales de Eppendorf y se almacena a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
3. Diluir 10 mg / ml Dispasa II 1:10 en PBS antes de su uso. Ponga el diluido II Dispasa sobre hielo.

2. Disecciona CD-1 a partir de embriones E10.5 Mujer Embarazada....

Resultados

Después Dispasa tratamiento II, el ectodermo del embrión tiende a ser flojo. Las prominencias faciales deben estar intactos después de la disección (Figura 2A). El ectodermo facial aislada es clara y libre de tejido mesénquima (Figura 2B). Para determinar la eficacia del protocolo y para detectar la contaminación cruzada que ensayaron para prosencéfalo expresó ZIC3 ^9, ectodérmica específico ⁵ CDH1 y mesenquimales específico SOX10 ¹⁰ usando la transcripta.......

Discusión

Este protocolo proporciona un método sencillo para separar ectodermo embrionario del ratón facial y el mesénquima basado en una etapa de tratamiento inicial Dispase II. En estudios anteriores, hemos realizado la disección de las prominencias faciales antes del tratamiento Dispasa II, pero hemos encontrado consistentemente que el mesénquima se vuelve "pegajoso" y más difícil de manipular. Nuestro nuevo protocolo evita este problema. Combinación Dispase II tratamiento con la fuerza física suave pipeteando arriba.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dispasa II (proteasa neutra, grado II)	Roche	4942078001	Make 10 mg/ml de solución madre de dispasa II en HBS. Alícuota y tienda a -20 ° C .
RNAlater	Ambion	AM7021