Hemos desarrollado un método simple, fiable, y relativamente barato para la intubación endotraqueal en ratones a través de la laringoscopia directa utilizando un otoscopio con un espéculo 2,0 mm. Esta técnica es atraumática y se puede utilizar para mediciones repetidas en experimentos crónicos. Nos resulta superior a la traqueotomía o previamente informó técnicas no quirúrgicas.
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Artículo de método
Intubación endotraqueal en ratones
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Resumen
Resumen
Los ratones, tanto de tipo salvaje y transgénicos, son el modelo de mamíferos principal en la investigación biomédica en la actualidad. La intubación y la ventilación mecánica son necesarios para los experimentos con animales enteros que requieren cirugía bajo anestesia profunda o mediciones de la función pulmonar. La traqueotomía ha sido el estándar para la intubación de la vía aérea en estos ratones para permitir la ventilación mecánica. Intubación orotraqueal se ha informado, pero no ha sido utilizado con éxito en muchos estudios debido a la dificultad técnica sustancial o un requisito para un equipo altamente especializado y caro. Aquí mostramos una técnica de laringoscopia directa utilizando un otoscopio equipado con un espéculo 2,0 mm y el uso de un catéter intravenoso 20 G como un tubo endotraqueal. Hemos utilizado esta técnica extensamente y fiable que intubar y llevar a cabo una evaluación precisa de la función pulmonar en los ratones. Esta técnica ha demostrado ser seguro, esencialmente sin pérdida de animales en manos experimentadas. Por otra parte, esta técnicapuede ser utilizado para estudios repetidos de ratones en modelos crónicos.
Introducción
El ratón de laboratorio ha suplantado a prácticamente todas las especies de mamíferos como el modelo principal de la biología y la biopatología. El ratón de laboratorio es la especie de mamífero más pequeño que se ha demostrado de forma clara y extensamente para ser de valor como modelo de enfermedades humanas y ha demostrado ser invaluable en los avances de nuestra comprensión de la biología humana y las enfermedades. El tiempo de gestación corto y sustancialmente menor costo ha permitido el desarrollo y estudio de ratones nulos y transgénicos como una herramienta común en la investigación biomédica. Sin embargo, el tamaño del ratón de laboratorio media (20-25 g) ha limitado su estudio en los estudios basados fisiológicamente o quirúrgicamente y, en consecuencia, algunos investigadores estudian las especies de mamíferos más grandes. Un impedimento para el uso de ratones en estos estudios es la dificultad encontrada con técnicas de intubación que permitan mediciones fisiológicas o procedimientos quirúrgicos extensos bajo anestesia profunda. Traqueotomía 1 se ha utilizado como un estándar TEchnique lugar de intubación debido a la mayor facilidad de realización de esta técnica y habilidad modesta requerido. Sin embargo, la traqueostomía no es propicio para los estudios de cirugía crónicas o de recuperación; Por lo tanto, se limita a experimentos agudos. Traqueotomía también puede ser una variable de confusión en la investigación en las que la inflamación o los reflejos fisiológicos sensibles son importantes.
Nuestro laboratorio ha probado la mayoría de las técnicas descritas por otros investigadores y los encontró inadecuada para una variedad de razones. La traqueotomía es demasiado traumático y provoca sangrado y la inflamación de las vías respiratorias. Mucho más problemático es que no se puede repetir factible. Muchas técnicas relativamente no invasivas que requieren una modesta inversión en equipos no son suficientemente fiables. Otras técnicas requieren equipos costosos que es difícil de justificar, sin saber si el equipo va a trabajar en una aplicación específica. Por lo tanto, tratamos de desarrollar una técnica no traumática que requiere no más tHan una modesta inversión en equipos especializados, podría llevarse a cabo de forma rápida y fiable, se podría repetir en modelos crónicos, y podría ser utilizado en un gran número de animales. Aquí mostramos una técnica de este tipo.
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Protocolo
1. Preparación de los animales
- Obtener los ratones que tienen más de 8 semanas y más de 20 g (ratones más pequeños pueden ser intubados por un experto).
- Anestesia
- Inyectar ratones con 20 mg / kg, cada uno, de ketamina y xilazina por vía intraperitoneal como una preanestésica. (Esta dosis es insuficiente para anestesiar completamente el ratón, sino que facilita la transferencia, después de la intubación, la ventilación mecánica.) Sin embargo, el ajuste de las dosis puede ser necesario de acuerdo a la respuesta anestésica en consulta con el veterinario institucional.)
- Inducir la anestesia en los ratones con 3,5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción de 90 a 120 seg.
- Observe la frecuencia respiratoria con cuidado. Se debe reducir la velocidad progresivamente a no menos de 45 latidos por minuto.
2. Preparación para la intubación
- Retire el ratón desde la cámara de inducción y pescuezo con fuerza.
- Utilice unas pinzas finas acolchadas para gentLY extender la lengua de la boca.
- Mantenga la extensión de la lengua mediante la celebración de la lengua entre los dos dedos y aplicando fuerza suave.
- Tire del ratón hacia arriba sobre el espéculo del otoscopio con un movimiento vertical.
- Mire a través del ocular del otoscopio mientras Scruffing firmemente y tire del ratón hacia arriba suavemente por la lengua y el pescuezo.
- Busque cuidadosamente las cuerdas vocales. Ellos deben ser fácilmente visible en este momento. El aditus laryngis (la estructura de la abertura laríngea) debería ser relativamente blanco. No debe haber movimiento de las cuerdas con cada respiración. Si las cuerdas no se mueven o están mal visualizadas, gire ligeramente el animal y hiperextender suavemente el cuello.
- Con la mano dominante, sostenga el 20 G, 1 en el catéter, con una longitud de 1 cm de la tubería PE10 se extiende a través de la punta del catéter, como un lápiz y la inserta en el lado del espéculo. La tubería de PE sirve como un estilete o candelilla.
- Dirigir el tubi PE10ng (estilete) a través de las cuerdas vocales y avanzar el catéter de 20 G (sonda endotraqueal) en la tubería de PE hasta que el centro es a nivel del incisivo inferior. Eliminar este estilete rápidamente.
- Saque con cuidado el animal fuera del espéculo y verificar la ubicación del tubo colocando al animal en un ventilador mecánico con 2% de isoflurano continua para mantener la anestesia general en todo el experimento. Visualice el aire expirado (burbujas) de pasar por una trampa de PEEP para confirmar la intubación. Aunque la intubación esofágica puede dar lugar a algunas burbujas, no será tan pronunciada o como consistente con la intubación endotraqueal. También, observar un trazado de presión de las vías respiratorias en caso de desviaciones negativas (Figura 1). Estos confirmar la colocación correcta del tubo. Como alternativa, coloque una pequeña cantidad de agua en el tubo de intravenosa, y conéctelo al tubo endotraqueal. Verificación de circulación hacia y desde el ratón con la respiración 2. En el caso de intubación esofágica, la prastreo resión revelará presiones significativamente más altos y no hay desviaciones negativas. Aunque tidal final de CO2 sería de gran ayuda, técnicamente esto sería muy difícil dado el pequeño volumen corriente (~ 200 l) y el equipo para hacer esto sería muy caro. Las técnicas simples descritas son totalmente suficiente y mucho menos caro. Si la anestesia isoflurano no está disponible, todos los procedimientos pueden llevarse a cabo usando ketamina 80-120 mg / kg en combinación con xilazina 10-20 mg / kg para la anestesia general.
3. Técnica alternativa: Laringoscopia directa con la Técnica otoscopio es fácilmente utilizados para otros fines, principalmente para la instilación directa de Sustancias de estudio en el pulmón.
- Inducir la anestesia en los animales con isoflurano solo para este procedimiento en 3.5% durante 90-120 segundos en la cámara de inducción.
- Scruff el animal fuertemente en la base del cráneo y extender la lengua suavementecon unas pinzas finas.
- La celebración de la lengua suavemente, tire el animal hacia arriba en el espéculo (sin modificar), hasta que el animal no se puede elevar aún más.
- Las cuerdas vocales se pueden visualizar más a menudo por esta técnica por sí sola, pero giran el animal y la hiper-extendido el cuello para ponerlas en vista completa.
- Avanzar en una pipeta de carga de gel que contiene el instilado a la glotis e inculcar el fluido. Debido a que el espéculo hace un sello con la hipofaringe el ratón aspirar cualquier líquido residual que no pasa por las cuerdas. Esto se comprueba fácilmente por el rhonchorous suena el ratón ahora hace cuando la respiración hasta que el líquido se distribuye completamente en los pulmones.
- Como alternativa, conecte la tubería PE10 a una jeringa de 0,5 ml que contiene 50 l de fluido con un bolo de aire detrás del líquido. Avanzar el tubo de PE con cuidado a través de las cuerdas vocales de 0,5 cm y descargar el contenido en las vías respiratorias lentamente. Sin embargo, el trauma de vez en cuando a las vías respiratorias inferiores se produce ucantar esta técnica sin una mejor entrega de la muestra.
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Resultados
La intubación con la técnica anterior es fiable y rápido. La colocación apropiada del tubo endotraqueal es más fácilmente verificado por la observación de burbujeo del gas espirado desde la rama de expiración sumergida de la del circuito del ventilador (por lo general en una trampa de PEEP) y desviaciones negativos en una presión de la vía aérea rastreo (Figura 1). Las desviaciones negativas en el seguimiento de la presión de las vías respiratorias son las más fiables. Otros han utilizado el movimiento ...
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Discusión
En este informe se describe una técnica sencilla y fiable para intubar ratones que es no traumática y puede ser utilizado en varias ocasiones en el mismo animal. Esta técnica se puede lograr con un simple laboratorio o equipos médicos que se pueden comprar por una suma modesta. La técnica de la laringoscopia directa, originalmente reportado por Hastings y colegas 4, también se puede utilizar para una variedad de propósitos, pero principalmente para entregar con precisión sustancias de ensayo en el tracto resp...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Una Beca Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos y una subvención T32-HL098062 del NHLBI de los Institutos Nacionales de Salud apoya este trabajo. Queremos reconocer y agradecer el asesoramiento de Randolph H. Hasting, MD, Ph.D. y el asesoramiento y apoyo de la Unidad de Medicina Veterinaria de la VA Healthcare System San Diego.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cabezal de otoscopio de operación | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Mango de otoscopio | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Espéculo Reutilizable | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Pinza Fina | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Soporte de abrazadera pequeño para sujetar el otoscopio | |||
| Vaporizador de isoflurano (circuito múltiple con manejo de gases residuales al vacío) | Summit Medical | $3,000 | |
| Flexivent (Ventilador para animales) | SCIREQ | $35,000 | |
| Catéter intravenoso (20 G, 1 pulgada) | BD | 381233 | $9.62 |
| Tubo de polietileno (PE10) (0.011 en diámetro interior, 0.024 pulgadas en diámetro exterior) 100 pies | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamina 100 mg/ml (10 botella de ml) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xilacina (botella de 100 ml) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurano (botella de 250 ml) | $15.00 | ||
| Bromuro de vecuronio 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
