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1. Fijación
Los fijadores son cancerígenos; use guantes y manejar los fijadores en una campana de humos. A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones se realizan sobre hielo y todas las soluciones debe ser filtrado antes de su uso. El uso de electrones microscopía de grado-reactivos.
Día 1
- Después de condiciones experimentales (por ejemplo, inyección viral, el tratamiento farmacológico), colocar la membrana con organotípicos de cortes de hipocampo en un 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri que contiene enfriado con hielo 0,1 M de tampón fosfato (tampón fosfato de Sorensen), pH 7,3. Añadir 1 a 2 ml de tampón fosfato 0,1 M directamente en la parte superior de las rodajas para mantenerlos fríos.
PASO FUNDAMENTAL: Siempre use amortiguadores recién preparados y fijadores. Asegúrese de que el pH del tampón está dentro del rango deseado. El hecho de no hacerlo puede dañar las estructuras celulares.
- Para aislar el subcampo CA1 de la rebanada, utilizar undesechable bisturí para cortar suavemente a través de la porción próxima a la DG, paralela a la capa de células CA1 (Figura 1). A continuación, corte la porción restante verticalmente para eliminar el subcampo CA3 y la subículo. Cortar una esquina de la rebanada para ayudar a identificar la superficie superior del tejido.
NOTA: En caso de no entrega viral de la proteína de interés se requiere, la lámina de tejido entero puede ser fijado después de que el soporte se extrae con un enjuagado suave de tampón enfriado con hielo. Esto es seguido por corte de la CA1.
Paso crítico: un seguimiento de la parte superior del tejido con el fin de seccionamiento adecuado de las rejillas más adelante.
- Retire cuidadosamente el tejido de la membrana utilizando la parte trasera del bisturí. Utilizar una pipeta Pasteur para transferir suavemente el tejido a una placa de 12-pocillos que contenía 0,1 M de tampón fosfato.
- Eliminar el tampón en el pocillo de la placa y añadir 500 & mu; l - 1 ml de helado de fijador (pH 7,3) compuesto de los siguientes: 0,1% de ácido pícrico, 1% de paraformaldehído, y 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M tampón fosfato. Incubar durante 2 horas a 4 ° C.
NOTA: El ácido pícrico puede ser explosivo cuando está seco. Manténgalo humedecido con agua en un recipiente herméticamente cerrado. Guárdelo en un lugar seco y bien ventilado.
- Retire el fijador del pozo y lavar las muestras 3 veces (20 min cada uno) en 0,1 M tampón fosfato.
- Incubar durante 40 min en 1% de ácido tánico (w / v) en tampón de maleato 0,1 M, pH 6,0.
- Enjuague dos veces (20 min cada una) en tampón de maleato.
- Incubar durante 40 min en acetato de uranilo al 1% (w / v) en tampón de maleato en la oscuridad. Acetato de uranilo es sensible a la luz y es radiactivo. Cubrir el vaso con Parafilm cuando se disuelve y almacenar cualquier tampón utilizado en la oscuridad a 4 ° C.
- Enjuague dos veces (20 min cada una) en tampón de maleato.
- Incubar durante 20 min en cloro platino 0,5%ide (w / v) en tampón de maleato.
- Enjuague dos veces (20 min cada una) en tampón de maleato. Almacenar las muestras a 4 º C hasta que estén listos para su posterior procesamiento.
2. La deshidratación y la incrustación
El óxido de propileno es cancerígeno. Evite los vapores al trabajar con ella en una campana de humos. El uso de etanol absoluto, 100% puro que no contiene ninguna traza de agua. Diluir esta etanol absoluto para producir diferentes concentraciones de deshidratación.
Día 2
- Incubar durante 5 min en etanol al 50% y después de 5 min en etanol al 70%.
- Incubar durante 15 min en 1% recién preparada p-fenilendiamina (PPD) en 70% de etanol.
- Enjuague tres veces en etanol al 70%.
- Incubar durante 5 min en 80% de etanol y después de 5 min en etanol al 95%.
- Incubar en 100% de etanol dos veces 5 min cada uno.
- Preparar viales de vidrio con tapón de rosca y asegúrese de que estén limpios y completamente secos. Transferir las rebanadas a viales de vidrio yetiquetar cada vial simple y clara.
- Incubar durante 5 min en 1:1 etanol: óxido de propileno.
- Incubar en óxido de propileno 100% dos veces 5 min cada uno.
- Añadir resina (Epon) a cada vial para hacer una mezcla 1:1 con óxido de propileno. Mezclar suavemente durante 2 horas. No agite los viales demasiado rigurosa para evitar las burbujas que puedan interferir con incrustación.
- Añadir resina para hacer una mezcla 3:1 con óxido de propileno, y se mezcla durante 2 h.
- Traslado al 100% de resina e incubar S / N.
Día 3
- Muestras Sandwich entre tiras de plástico ACLAR y cura durante 24 horas a 60 º C.
3. De sección y de montaje en Grids
Día 4
- Cortar semi-delgadas (0,5 micras) y las secciones se tiñen con azul de toluidina al 1% + 1% de bórax para determinar la orientación correcta de muestras.
- Cortar secciones ultrafinas (60 nm) y montar en rejillas de níquel, una sección por la red.
4. La inmunohistoquímica
Todos los tampones y el agua debe ser filtrada antes de su uso.
Día 5
- Colocar una gota (~ 50 l) de tampón de Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, en un trozo de Parafilm limpias sobre una superficie plana. Suavemente levante el grid con pinzas limpias por el borde y flotar en el búfer, sección hacia abajo, y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Drenar el exceso de líquido de la red mediante la colocación de lado de la sección hacia arriba sobre papel de filtro y, a continuación flotan en 50 mM de glicina en T / PB durante 15 min a RT.
PASO FUNDAMENTAL: Para evitar la excesiva "carry-over" de soluciones de gota solución de una a otra durante las incubaciones, drenar el exceso de líquido tocando suavemente el borde de la red # 1 en papel de filtro entre cada cambio de solución. También quite cualquier solución atrapado entre los brazos de la EM Pinzas de sujeción de la red por capilaridad suavemente con un trozo de papel de filtro entre los brazos de pinzas mientras ensutocar las partes no se sequen completamente.
- Secar la rejilla con papel de filtro y, a continuación flotan en la solución de bloqueo que contiene 2,5% de BSA y 2,5% el suero del animal del anticuerpo secundario en T / PB durante 30 min a RT.
- Incubar con anticuerpo primario (en T / PB) a TA o O / N a 4 º C. El tiempo óptimo y la temperatura de incubación, así como la concentración de anticuerpos, necesita ser determinado experimentalmente.
- Lavar la rejilla de tres veces (2 min cada una) con T / PB.
- Incubar con anticuerpo secundario (1:20 anti-conejo o anti-ratón acoplado a oro nm 10) durante 1 hora a RT.
- Lavar tres veces (2 min cada una) con T / PB.
- Postfix con 2% de glutaraldehído en T / PB durante 5 min.
- Lavar tres veces (2 min cada una) con T / PB y luego tres veces (2 min cada una) con agua filtrada.
- Incubar con acetato de uranilo al 2% en agua durante 10 min.
Aunque la red está manchando, prepare un CO 2-cámara libre por placingc trozo de Parafilm en el centro de una placa Petri de vidrio. A continuación, coloque 4-6 pastillas de NaOH en el plato todo el Parafilm para absorber el CO 2 en el aire. Mantener la parte superior cerrada durante unos pocos minutos. Utilizar una pipeta Pasteur y transferir rápidamente un pequeño volumen de solución de citrato de plomo de Reynold para la Parafilm en el plato Petri de vidrio. Abrir la tapa lo suficiente para insertar la pipeta Pasteur para minimizar la re-introducción de CO 2 en la cámara.
NOTA: Para hacer una solución de citrato de plomo de Reynold, hervir 100 ml de agua desionizada en un horno de microondas y dejar enfriar en un recipiente hermético. En un matraz aforado de 50 ml con tapón, mezcla de 1,33 g de nitrato de plomo, 1,76 g de citrato sódico y 30 ml de agua hervida agitando vigorosamente durante 1 min. Luego agitar intermitentemente durante 30 min. A esta solución turbia, añadir 8 ml de hidróxido de sodio 1 M y lentamente invertir el matraz varias veces. Solución se hará claro. Llevar la solución a 50 ml con el wa hervidater. Guarde la solución cerrado herméticamente. Si aparece precipitado, desechar y hacer uno nuevo.
- En tres vasos más pequeños preparar agua caliente, desionizada recién hervida. Lavar el acetato de uranilo por inmersión de la rejilla en el primer vaso de precipitados y suavemente remolino alrededor de 30 seg. Repita este paso en los otros dos vasos de precipitados.
- Abrir la parte superior de la cápsula Petri de vidrio sólo lo suficiente para colocar la rejilla en la gota de solución de citrato de plomo de Reynold. Si es posible, use una mascarilla mientras se hace esto para evitar respirar el citrato de plomo y evitar la formación de precipitado. Incubar durante 10 min.
- Abra la tapa lo suficiente para quitar la rejilla. Evite respirar el citrato de plomo. Lavar la rejilla tres veces por inmersión secuencial en tres vasos de precipitados con agua tibia, destilada recién hervida. Que la rejilla seco en un trozo de papel de filtro, sección hacia arriba. La muestra está ahora lista para el microscopio electrónico.