Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Resumen

La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialmente difícil en los estudios de EM. Aquí, se adopta un procedimiento que ha sido utilizado para preservar las estructuras y los antígenos en el SNC para estudiar y caracterizar proteínas sinápticas del hipocampo de rata en las neuronas piramidales CA1.

Resumen

Inmunomicroscopía es una herramienta poderosa para estudiar moléculas biológicas a nivel subcelular. Anticuerpos acoplados a marcadores densos en electrones tales como oro coloidal puede revelar la localización y distribución de antígenos específicos en diversos tejidos ^1. Las dos técnicas más utilizadas son las técnicas de incrustación de pre-y post-inmersión. En inmuno-electrónica pre-incrustación de microscopía (EM) técnicas, el tejido debe ser permeabilizan para permitir la penetración de anticuerpos antes de que sea incorporado. Estas técnicas son ideales para la conservación de estructuras, pero pobre penetración del anticuerpo (a menudo sólo los pocos micrómetros primera) es un inconveniente considerable ^2. Los métodos de marcaje post-incrustación puede evitar este problema, ya que el etiquetado se lleva a cabo en secciones de tejidos fijados donde los antígenos son más fácilmente accesibles. A través de los años, un número de modificaciones han mejorado los métodos de incrustación de post-inmunoreactividad para mejorar y preservar la ultraestructura Fijación tisular es una parte crucial de los estudios de EM. Fijadores químicamente reticular las macromoléculas para bloquear las estructuras de tejido en su lugar. La elección del fijador no sólo afecta a la conservación estructural, sino también la antigenicidad y el contraste. El tetróxido de osmio (OsO _4), formaldehído, glutaraldehído y han sido los fijadores estándar durante décadas, incluyendo para el sistema nervioso central (SNC) tejidos que son especialmente propensos a daños estructurales durante el tratamiento químico y físico. Desafortunadamente, OsO ₄ es altamente reactivo y se ha demostrado para enmascarar antígenos ^6, resultando en el etiquetado pobre e insuficiente. Enfoques alternativos para evitar la fijación química incluyen la congelación de los tejidos. Pero estas técnicas son difíciles de realizar y requieren instrumentación costosa. Para resolver algunos de estos problemas y para mejorar el etiquetado CNS tejido, Phend et al. reemplazado Oso ₄ con acetato de uranilo (UA) y tánico acid (TA), introducido con éxito y modificaciones adicionales para mejorar la sensibilidad de detección del antígeno y la conservación estructural en tejidos del cerebro y la médula espinal ^7. Hemos adoptado esta osmio sin post-incrustación método de tejido cerebral de rata y optimizado la técnica de inmuno-etiquetado para detectar y estudiar las proteínas sinápticas.

Se presenta aquí un método para determinar la localización ultraestructural de las proteínas sinápticas del hipocampo de rata en las neuronas piramidales CA1. Utilizamos organotípicos rebanadas de hipocampo en cultivo. Estas rodajas mantener la circuitería trisynaptic del hipocampo, y por lo tanto son especialmente útiles para el estudio de la plasticidad sináptica, un mecanismo ampliamente cree que la base de aprendizaje y memoria. Organotípicos rebanadas de hipocampo de días postnatales 5 y 6 de ratón / rata cachorros se pueden preparar como se ha descrito previamente ^8, y son especialmente útiles para agudamente desmontables o sobreexpresan proteínas exógenas. Anteriormente hemos utilizado este protocolo para characterize neurogranina (Ng), una proteína específica de neuronas con un papel crítico en la regulación de la función sináptica ^8,9. También lo hemos utilizado para caracterizar la localización ultraestructural de la calmodulina (CaM) y Ca ^{2 +} / CaM dependiente de la proteína quinasa II (CaMKII) ^10. Como se ilustra en los resultados, este protocolo permite una buena conservación ultraestructural de las espinas dendríticas y el etiquetado eficiente de Ng para ayudar a caracterizar su distribución en la columna ^8. Además, el procedimiento aquí descrito puede tener una amplia aplicación en el estudio de muchas otras proteínas que participan en las funciones neuronales.

Protocolo

1. Fijación

Los fijadores son cancerígenos; use guantes y manejar los fijadores en una campana de humos. A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones se realizan sobre hielo y todas las soluciones debe ser filtrado antes de su uso. El uso de electrones microscopía de grado-reactivos.

Día 1

1. Después de condiciones experimentales (por ejemplo, inyección viral, el tratamiento farmacológico), colocar la membrana con organotípicos de cortes de hipocampo en un 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri que contiene enfriado con hielo 0,1 M de tampón fosfato (tampón ....

Resultados

La Figura 2B muestra un ejemplo de la distribución de moléculas endógenas NG en las espinas dendríticas de las neuronas piramidales CA1 del hipocampo. Rejillas de níquel con ultrafinos (60 nm) tejidos que contienen la región CA1 del hipocampo (como se ve en la Figura 2A) se trataron en 1% T / PB, 50 mM glicina, luego se bloquearon con 2,5% de BSA y 2,5% de suero antes de la incubación con anti anticuerpo-Ng. Después de lavar con T / PB, rejillas se cubrieron entonces en anti-conejo anti.......

Discusión

En este protocolo, hemos adoptado el método Phend y Weinberg para el cerebro y los tejidos de la médula espinal para estudiar las espinas dendríticas en las culturas de ratas rebanada hipocampo. Las espinas dendríticas en el hipocampo CA3-CA1 área son delicadas estructuras que contienen una gran variedad de proteínas que desempeñan papeles importantes en la regulación de las funciones neuronales. El método presentado proporciona un enfoque equilibrado para lograr la antigenicidad mayor manteniendo al mismo tiempo una bu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
60 x 15 mm poliestireno Placa de Petri	Falcon	351007
Bisturí desechable	EXELINT	29552
Insertos para cultivos celulares	Millipore	PICM03050
10 nm Cabra-anti-conejo	oro Microscopía Electrónica Sciences	25108
Anticuerpo Anti-Neurogranina	Millipore	AB5620
100% Ácido pícrico	Ciencias de la microscopía electrónica	19550
96% Paraformaldehído	Acros Organics	AC41678-0030
25% Glutaraldehído (grado EM)	Sigma	G5882
Acetato de uranilo	Ciencias de la microscopía electrónica	22400
p-fenilendiamina	Sigma	P6001
Cloruro de	platino (IV)Sigma	379840
Ciencias de Microscopía Electrónica de Ácido	Tánico	21710