Revestimientos de grafeno para Implantes Biomédicos

Resumen

El grafeno ofrece potencial como un material de recubrimiento para implantes biomédicos. En este estudio hemos demostrado un método para el revestimiento de aleaciones de nitinol con capas nanométricas de grafeno y determinar cómo grafeno puede influir en la respuesta del implante.

Resumen

Grafeno atómicamente lisa como un revestimiento de superficie tiene el potencial de mejorar las propiedades de los implantes. Esto demuestra un método para el revestimiento de aleaciones de nitinol con capas nanométricas de grafeno para aplicaciones como un material de stent. El grafeno se hizo crecer en sustratos de cobre a través de la deposición química de vapor y luego se transfirieron a sustratos nitinol. Con el fin de entender cómo el recubrimiento grafeno podría cambiar la respuesta biológica, la viabilidad celular de las células endoteliales de aorta de rata y células de músculo liso de aorta de rata fue investigado. Además, el efecto de grafeno recubrimientos sobre la adhesión celular y la morfología se examinó con microscopio confocal fluorescente. Las células se tiñeron para la actina y los núcleos, y no había diferencias notables entre prístinas muestras de nitinol en comparación con grafeno recubiertos muestras. La expresión de actina total a partir de células de músculo liso de aorta de rata se encontró mediante Western blot. Adsorción de proteínas características, un indicador para trombogenicidad potencial, were determinado para el fibrinógeno y albúmina de suero con electroforesis en gel. Además, la transferencia de carga a partir de fibrinógeno al sustrato se dedujo utilizando la espectroscopia Raman. Se encontró que el recubrimiento de grafeno en nitinol sustratos cumplen los requisitos funcionales de un material de la endoprótesis y mejorar la respuesta biológica en comparación con sin revestir nitinol. Por lo tanto, el grafeno recubierto nitinol es un candidato viable para un material de stent.

Introducción

Las últimas tres décadas han sido testigos de descubrimiento de nuevos materiales basados ​​en terapias y dispositivos para tratamientos de enfermedades y diagnósticos. Nuevos materiales de aleación tales como el nitinol (NiTi) y acero inoxidable a menudo se utilizan en la fabricación del implante biomédico debido a sus propiedades mecánicas superiores. ^1-3 Sin embargo, numerosos desafíos debido a la citotoxicidad material exógeno, bio-y hemo-compatibilidad. La naturaleza metálica de estas aleaciones resultados pobres en bio-y hemocompatibilidad debido a la lixiviación de metales, la falta de adhesión celular, la proliferación, y trombosis cuando entra en contacto con la sangre que fluye (tales como catéteres, injertos de vasos sanguíneos, endoprótesis vasculares, válvulas cardiacas artificiales etc.). ^{1, 4, 5} La interacción de proteínas o células vivas con la superficie del implante puede dar lugar a una fuerte respuesta inmunológica y el subsiguiente cascada de reacciones bioquímicas pueden afectar negativamente a la funcionalidad del dispositivo. Por lo tanto, se Pertinent para lograr el control sobre las interacciones entre los implantes biomédicos y su entorno circundante biológico. Modificación de la superficie se emplea a menudo para reducir o prevenir la respuesta adversa fisiológico procedente de material del implante. Un recubrimiento de superficie ideal se espera que tenga la fuerza de adhesión alta, inercia química, de alta lisura, y buena hemo-y biocompatibilidad. Anteriormente, numerosos materiales como carbono tipo diamante (DLC), SiC, TiN, TiO ₂ y muchos materiales poliméricos han sido probados como bio-compatibles recubrimientos de implantes de superficie. ^{1, 6-23} Sin embargo, estos materiales son todavía incapaces de cumplir con todos los los criterios funcionales para un recubrimiento de la superficie del implante adecuado.

El descubrimiento del átomo de espesor de capa sp ² de carbono, conocido como el grafeno, ha abierto las puertas para el desarrollo de nuevos materiales multifuncionales. El grafeno se espera que sea un candidato ideal para el recubrimiento de la superficie del implante, ya queEs químicamente inerte, lisa atómica y de alta durabilidad. En esta carta, se investiga la viabilidad de grafeno como un revestimiento superficial para implantes biomédicos. Nuestros estudios muestran que el grafeno nitinol revestido (Gr-NiTi) cumple con todos los criterios funcionales, y adicionalmente soporta músculo liso excelente y el crecimiento celular endotelial conduce a la proliferación celular mejor. También encontramos que la adsorción de albúmina sérica en Gr-NiTi es más alto que el fibrinógeno. Es importante destacar que, (i) nuestras mediciones espectroscópicas detalladas confirmó la falta de transferencia de carga entre el grafeno y fibrinógeno sugiere que el recubrimiento de grafeno inhibe la activación plaquetaria por los implantes, (ii) los revestimientos de grafeno no presentan ninguna toxicidad significativa en vitro de líneas de células endoteliales y de músculo liso que confirman su biocompatibilidad, y (iii) los revestimientos de grafeno son químicamente inertes, resistentes e impermeables en que fluye la sangre ambiente. Estos hemo-y las propiedades biocompatibles, junto con st altarength, inercia química y durabilidad, hacen que los recubrimientos de grafeno como un recubrimiento superficial ideal.

Protocolo

1. El grafeno recubrimiento de NiTi

1. Las muestras de grafeno utilizados en este estudio se cultivaron en cobre (Cu) sustratos utilizando la técnica de deposición química de vapor, y se transfirió posteriormente a 4,5 mm ² sustratos de NiTi.
2. Cu láminas (1 cm x 1 cm) se colocaron en un horno de tubo de 1 pulgada de cuarzo y se calentó a 1.000 ° C en presencia de 50 sccm de H ₂ y 450 sccm de Ar.
3. Metano siguiente, (1 sccm y 4) se introduce en el horno a diferentes caudales de 20-30 min. Las muestras se enfriaron finalmente a temperatura ambiente bajo flujo de H _2, Ar y CH _4.
4. A continuación, las láminas de Cu fueron spin-revestido con PMMA (diluido con 4% anisol) a 4.000 rpm seguido por un tratamiento térmico durante 5 min a 150 ° C. El grafeno unido a PMMA capa se obtuvo por el grabado de la lámina de Cu utilizando Transene Inc., CE-100 reactivo de ataque, y posterior aclarado en 10% de HCl y agua desionizada durante 10 min.
5. La splos se transfirieron a sustratos de NiTi (4,5 mm ²⁾ y recocidas a 450 ° C en Ar (300 sccm) y H ₂ (700 sccm) durante 2 h para eliminar el PMMA. Finalmente, los substratos fueron lavados con acetona para disolver el residuo PMMA para obtener la muestra Gr-NiTi. Un monocromador de rejilla XY Dilor triple fue utilizado para la caracterización micro-Raman (usando objetivo 100X) de todos los NiTisamples GR-con la excitación 514,5 nm de un láser de iones Ar ^+.

2. Toxicidad in vitro de Gr-NiTi

Células endoteliales de aorta de rata (célula aplicación Inc.,) fueron cultivadas en una gelatina recubierta 8 diapositiva cámaras. Para probar el crecimiento celular, prístino y Gr-NiTisubstrates se colocaron en pocillos sin recubrimiento de gelatina. Exploración de imágenes de microscopía electrónica se obtuvieron utilizando un Hitachi S-4800 SEM. Además, las células de músculo liso de aorta de rata fueron cultivadas también en Cellbind placas de 96 pocillos como un grupo de control (Corning) en Dulbecco Medio de Eagle Modificado (ATCC).

1. Para el ensayo de viabilidad celular, las células (células del músculo liso y endoteliales tanto) se sembraron a 10 ⁵ células / pocillo en los pocillos que contienen prístina NiTi, 1 sccm o 4 sccm Gr-NiTi sustratos, donde la sccm indicado corresponde al flujo de metano usado en la ECV crecimiento de grafeno. Las células se hicieron crecer durante el período de tiempo deseado en una incubadora a 37 ° C y 5% CO _2, el intercambio de medios de comunicación cada dos días.
2. En el punto de tiempo final, se retiró el medio y medio fresco que contenía 0,5 mg / ml de azul de tiazolilo tetrazolio (MTT o obtuvieron de Sigma) se añadió a cada pocillo. Las células fueron incubadas por un período adicional de 3 h. Para el ensayo de MTS, se retiró el medio en el punto de tiempo final y se reemplazó con 120 l de MTS solución de trabajo (la célula de nivel 96 acuosa, Promega) y se incubaron durante 3 hr.
3. A continuación, se retiró el medio suavemente y 100 ml de dimetilsulfóxido (Sigma) se añadió a cada pocillo. Después alloala 10 min para los cristales de MTT para disolver, la solución se transfirió a otra placa de pocillos. Para el ensayo de MTS, no dimetilsulfóxido se añadieron a los pocillos. Contenido de los pocillos fueron trasladados a una nueva placa.
4. Se leyó la absorbancia a 490 nm y el porcentaje de viabilidad se determinó mediante la normalización de absorbancia a la absorbancia media de la muestra prístina NiTi. Al menos cinco repeticiones fueron realizadas para cada tipo de muestra.

3. Los estudios de microscopía confocal de Morfología Celular

1. Para formación de imágenes confocal de células de músculo liso de aorta de rata, sustratos se colocaron en un portaobjetos 8-cámara (Thermo Scientific). Las células se sembraron a 25.000 células / cámara y se incubaron durante 3 días a 37 ° C y 5% CO _2.
2. Las células fueron fijadas en el sustrato con 4% de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato durante 20 min.
3. Permeabilizaron con 0,1% Triton-X durante 1 min.
4. Actina se tiñó con Alexa Fluor 488 faloidina (Life) Tecnologías. 100 l de AlexaFluor 488 phalloidin a 200 unidades / ml en metanol se añadió a 1,9 ml de solución salina tamponada con fosfato. Las células se tiñeron con 250 l de AlexaFluor 488 faloidina durante 45 min y después se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato.
5. Los núcleos fueron montadas con Vectashield medio de montaje fluorescente que contiene DAPI (Vector Laboratories). Confocal de imágenes se recopilaron mediante un Confocal Nikon TI. Una cámara de sembrado con células sin ningún sustrato se usó como control.

4. La adsorción de proteínas Estudios

1. Dimensiones del sustrato se mide con un calibrador antes de iniciar los experimentos de adsorción de proteínas. Se tomaron tres mediciones para cada lado de las muestras de aproximadamente cuadrados y se promediaron para obtener la longitud y la anchura.
2. Cada muestra, prístino NiTi, 1sccm y 4sccm Gr-NiTiwere incubaron con 1 mg / ml de albúmina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o 1 mg / ml de fibrinógeno en PBS a habitación temperatura durante 3 horas.
3. Igual muestras se combinaron en un tubo de microcentrífuga con 200 l de tampón de muestra reductor y se hirvieron durante 5 min.
4. Las muestras se diluyeron luego en un tampón Tris / glicina / SDS (Bio-Rad) y se ejecuta a través de un 4-15% en gel de electroforesis de poliacrilamida Tris (Bio-Rad) a 90 V durante 100 min.
5. Los geles se tiñeron con Rojo SYPRO. Diluir SYPRO Red (Life Technologies) solución madre a 1:5,000 en ácido 7,5% v / v acético. Mancha de geles durante 60 min.
6. Geles de imagen utilizando un SP Flourchem (Alpha INNOTECH). Intensidad de fluorescencia se cuantificó utilizando el software ImageJ. La intensidad de fluorescencia de cada muestra se normalizó por el área total de sustrato y la adsorción de fibrinógeno se comparó con la adsorción de albúmina.

5. Western blot para la expresión de proteínas

1. Western blot se realizó para analizar la actina total en células de músculo liso aórtico de rata. Las células se sembraron a 10.000 células / sustrato en un 96-well plato.
2. Las células se cultivaron durante tres días antes de la eliminación de los medios de comunicación. La proteína total se extrajo utilizando tampón RIPA y un estándar de ensayo BCA (lambda) se realizó para cuantificar la proteína total.
3. Las muestras se diluyeron a la misma concentración en RIPA y luego se hierve en un tampón de muestra reductor para 5 min.
4. Las proteínas fueron separadas por un gel de poliacrilamida al 4-15% Tris a través de electroforesis a 90 V durante 100 min. Una proteína caleidoscopio estándar (Bio-Rad) se utilizó para evaluar el peso molecular de la proteína.
5. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF y se bloquearon con un 1% de leche sin grasa seca (Bio-Rad) solución.
6. Actina total fue etiquetado con un anticuerpo de conejo anti-actina de rata (Sigma). Un BM quimioluminiscente kit (Roche) se utilizó para detectar el anticuerpo primario. Las membranas fueron imágenes utilizando FlourChem SP equipos de imagen y la intensidad de fluorescencia se midió utilizando el software ImageJ. La intensidad de fluorescencia se normalizó mediante la comparación de la pristine NiTisample.

Resultados

. Figura 1 a) ECV crecido grafeno policristalino sobre láminas de Cu imita los granos de cristal de metal (barra de escala: 10 micras). b) Espectro Raman de 1 sccm (4 sccm) grafeno monocapa muestra intenso (relativamente débil) G 'banda indica (capa de unos pocos) como carácter de preparados grafeno. c) imagen de AFM de grafeno transfiere a NiTi muestra una rugosidad de ~ 5 nm. Barra de escala = 500...

Discusión

Biocompatibilidad y citotoxicidad: La deposición química de vapor (CVD) dio muestras policristalinas de grafeno que imitaban granos de cristal de Cu, como se muestra en la Figura 1a. Se empleó la espectroscopia de Raman para confirmar la presencia de la monocapa (capa pocos) grafeno en 1 sccm (4 sccm) muestras (véase la figura 1b). Claramente, un sccm (4 sccm) muestras exhiben banda indicativa de monocapa intenso (relativamente débil) G '(capa de unos pocos) grafeno.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			Reactivo
Dulbecco Modificado Medio Eagle	ATCC	30-2002
Tiazolil azul tetrazolio	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 Aqueous Una célula proliferación solución de ensayo (MTS)	Promega	G3582
Sulfóxido de dimetilo	Sigma-Aldrich	D8418
36,5% de formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Alexafluor 488 phalloidin	Life Technologies	A12379
Vectashield medio de montaje con DAPYo	Vector Laboratories	H-1200
La albúmina sérica humana	Sigma-Aldrich	A9511
El fibrinógeno humano
Tris / Glicina / SDS	Bio-Rad	161-0732
Ready Gel Gel Tris-HCl	Bio-Rad	161-1158
Ácido acético	Sigma-Aldrich	45726
SYPRO Red	Life Technologies	S-6653
Proteína bajo ensayo BCA	Lamda Biotech	G1003
Precision Plus Protein estándar Kaleidoscope	Bio-Rad	161-0375
Immun-Blot PVDF membrana	Bio-Rad	162-0177
Blotting bloqueador grado de leche sin grasa seca	Bio-Rad	170-6404XTU
Anti-actina de anticuerpos producido en conejo	Sigma-Aldrich	A2066
BM quimioluminiscencia Western Blotting kit (mouse / conejo)	Roche Applied Science	11520709001
Tampón RIPA	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi (51% Ni, 49% de Ti)	Alfa-Aesar	44953
			Equipo
Horiba JobinYvon	Raman	Dilor XY 98
Nikon	Microscopio confocal	Eclipse TI microscopio
Thermoscientific	Lector de placas
Bio-Rad	Fuente de alimentación	164-5050	PowerPac fuente de alimentación básica
Bio-Rad	La electroforesis de células	165-8004	Mini-PROTEAN tetra célula
Bio-Rad	Gel portacasetes	170-3931	Gel Mini cassette