Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

Resumen

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Resumen

Se presenta un protocolo de cribado de alto rendimiento rápido y barato para identificar reguladores de la transcripción de la alfa-sinucleína, un gen asociado con la enfermedad de Parkinson. Células 293T se transfectaron de forma transitoria con plásmidos de una biblioteca de expresión ORF dispuestos, junto con plásmidos informadores de luciferasa, en un formato de microplaca de un gen-por-así. Actividad de la luciferasa de la luciérnaga se ensaya después de 48 horas para determinar los efectos de cada gen de la biblioteca después de la transcripción alfa-sinucleína, normalizada para la expresión de una construcción de control interno (un promotor de hCMV dirigir la luciferasa de Renilla). Este protocolo se ve facilitada por un robot de sobremesa encerrado en una cabina de bioseguridad, que realiza la manipulación de líquidos aséptica en formato de 96 pocillos. Nuestro protocolo de transfección automatizado es fácilmente adaptable a la producción de alto rendimiento biblioteca lentiviral u otros protocolos de cribado funcionales que requieren triples-transfecciones de un gran número de plásmidos de la biblioteca únicos en conjugadoFuncione con un conjunto común de plásmidos auxiliares. También presentamos una alternativa económica y validado para comercialmente disponibles reactivos de luciferasa duales, que emplea el PTC124, EDTA, y pirofosfato para suprimir la actividad luciferasa de luciérnaga antes de la medición de la luciferasa de Renilla. El uso de estos métodos, que exhibió 7.670 genes humanos y se identificaron 68 reguladores de la alfa-sinucleína. Este protocolo es fácilmente modificables para atacar otros genes de interés.

Introducción

La capacidad de identificar elementos reguladores genéticos clave y los factores que actúan sobre ellas es fundamental para la exploración de numerosos procesos biológicos. Sin embargo, los factores que regulan la expresión de genes en los tipos de células raras, como la identificación de poblaciones neuronales específicas, puede ser un reto. Aquí, se presenta un protocolo para la identificación de nuevos reguladores transcripcionales de alfa-sinucleína (SNCA), un gen asociado con la enfermedad de Parkinson y expresado en las neuronas dopaminérgicas en la substantianigra pars compacta de la región del cerebro medio. Esto lo logramos mediante una pantalla reportero de....

Protocolo

Para una visión general experimental, ver Figura 1.

1. Preparar reportero plásmidos que contienen la alfa-sinucleína Promotor

Los elementos reguladores del gen de la alfa-sinucleína (Figura 2) abarcan aproximadamente 10 kb, desde el upstream NACP (A no componente beta amiloide) secuencia de repetición del dinucleótido ^1,2 través intrón 2 ^3. Incluimos una parte de esta región en nuestro reportero construir. Encontramos que los plásmidos que contienen el intrón 2 se requieren procedimientos especiales para el crecimiento, que se detallan a continuación. Los p....

Resultados

Luciferase valores típicos, F: R ratios y valores de inducción para un único medio de placas se muestran en la Figura 4 Nota del éxito en el pozo H2, un inductor de 32 veces.. Los genes que causan una toxicidad excesiva (por ejemplo, así E3), o los pozos que fueron mal transfectadas, producirán valores bajos para ambos luciérnaga y luciferasa Renilla, pero un valor medio de inducción. Los genes que causan la inducción no específica de la actividad de la luciferasa, tal vez a través de .......

Discusión

Alfa-sinucleína se ha implicado en la enfermedad de Parkinson (EP) como un componente de los cuerpos de Lewy ^4, inclusiones intracelulares considerados patognomónicos de la enfermedad. Numerosos estudios de asociación del genoma han relacionado polimorfismos de nucleótido único en la alfa-sinucleína con un mayor riesgo para los esporádicos PD ^5,6,7. Aunque menos común que la enfermedad de Parkinson esporádica, PD familiar puede estar también causada por mutaciones en alfa-sinucleína ^8, a.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material
QIAQuick PCR Kit de purificación	Qiagen	28106
PureLink Kit de extracción rápida de gel	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Kit de minipreparación de plásmidos	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Kit de Plásmido Maxiprep	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent-Robot
Puntas de pipeta con filtro	Agilent	19477-022
Robot Puntas de pipeta sin filtro	Agilent	19477-002
Placas de 96 pocillos de fondo claro	Embalses Corning	3610
	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Placa de poliestireno de 96 pocillos con fondo en V	Greiner	651101
Placa de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V	Greiner	651201
Cubiertas de placa adhesiva	CryoStuff	#FS100
Reactivo
Phusion ADN polimerasa	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Intestino de ternera Fosfatasa alcalina	Roche	10713023001
T4 ADN ligasa	Nueva Inglaterra Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Células competentes	Invitrogen	11635-018
Eficiencia de subclonación DH5 y alfa; Células Competentes	Invitrogen	18265-017
DMEM sin Rojo de Fenol	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacina	CellGro	61-277-RF
Tris-Clorhidrato en polvo	Sigma	93287
Tris-Base Polvo	Sigma	93286
Triton X-100 Líquido Puro	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C– nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003