Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Resumen

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Resumen

La insuficiencia cardíaca avanzada representa un importante desafío clínico insatisfecha, derivada de la pérdida de células musculares viables y / o funcional totalmente cardíacas. A pesar de la terapia óptima del fármaco, la insuficiencia cardiaca es una causa principal de mortalidad y morbilidad en el mundo desarrollado. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que recapitulan precisión normal y enfermo fisiología humana miocardio in vitro. Del mismo modo, los principales retos de la biología regenerativa cardíaca giran en torno a la identificación y el aislamiento de pacientes específicos de células progenitoras cardiacas en cantidades clínicamente relevantes. Estas células tienen que luego se ensamblan en tejido funcional que se asemeja a la arquitectura del tejido del corazón nativo. Impresión por microcontacto permite la creación de formas precisas que se asemejan a proteínas micropatterned organización estructural del corazón, proporcionando así señales geométricas para controlar la adhesión celular espacialmente. En estadescribimos nuestro enfoque para el aislamiento de las células del miocardio altamente purificada a partir de células madre pluripotentes de diferenciación in vitro, la generación de superficies de crecimiento de células micropatterned con proteínas de matriz extracelular, y el conjunto de las células madre derivadas de células del músculo cardiaco en el tejido de miocardio anisotrópico.

Introducción

A pesar de los recientes avances en el tratamiento médico, la insuficiencia cardíaca avanzada sigue siendo una causa importante de mortalidad y morbilidad en los países desarrollados. El síndrome clínico surge de una pérdida de tejido funcional del miocardio y, posteriormente, la incapacidad del corazón insuficiente para satisfacer las demandas metabólicas de los individuos afectados. Puesto que el corazón tiene una capacidad regenerativa limitada, el trasplante autólogo de corazón es el único tratamiento actual clínicamente aceptado directamente dirigidas a la reposición de tejido perdido corazón funcional. Inconvenientes significativos de trasplante de corazón, incluyendo un número limitado de corazones de donantes y la necesidad de que a largo plazo la terapia inmunosupresora, impide el uso generalizado de esta terapia. Como resultado, la terapia médica ha sido el pilar del tratamiento para los pacientes con enfermedades del corazón. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que precisa recapitular fisiología del miocardio normal y enfermo in vitro.

La convergencia reciente de la biología de células madre y la tecnología de la ingeniería de tejidos plantea nuevas vías prometedoras para la regeneración cardiaca. Generación de tejido miocárdico funcional de un renovable específica del paciente fuente, sería un avance importante en el campo. Esto permitiría el desarrollo de enfermedades específicas ensayos celulares para el desarrollo y descubrimiento de fármacos y podría establecer las bases para la medicina regenerativa cardíaca. Humanos madre embrionarias (ES) de células y, significativamente más, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) representan una potencialmente renovable específica del paciente fuente de células progenitoras y los miocitos ventriculares maduros ventriculares. La combinación de la biología de células madre y la ingeniería de tejidos aborda este problema mediante la generación de tejido cardiaco funcional in vitro que se pueden utilizar en el desarrollo de ensayos celulares para el descubrimiento de medicamentos o en cardíacos enfoques regenerativos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca avanzada.

_content "> Un reto fundamental en la regeneración cardiaca ha sido la identificación de un tipo celular óptimo. Una amplia variedad de células han sido estudiados ^1, sin embargo hasta la fecha, a pesar de diferentes precursores multipotenciales cardiogénicas de diversas fuentes han sido descubiertos, la identificación de una célula fuente que cumpla con los requisitos críticos tales como el compromiso con el destino de la célula miogénica, el mantenimiento de la capacidad de expandir in vivo o in vitro y la composición a un tejido miocárdico funcional ha demostrado ser un problema central ^2. Hemos descrito previamente un doble sistema murino transgénico que permite el aislamiento de poblaciones altamente purificadas de células progenitoras comprometidas ventriculares (CVP) de la diferenciación de células ES in vitro. Hemos generado un nuevo ratón doble transgénico que expresa la proteína fluorescente roja DsRed bajo el control de un potenciador dependiente de ISL1 del gen y MEF2C el aumento de proteína verde fluorescente bajo el control deel específico del corazón Nkx2.5 potenciador. Sobre la base de este sistema reportero fluorescente de dos colores, progenitores corazón primero y segundo de campo de las células ES en desarrollo pueden ser aislados por medio de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de acuerdo con su expresión de genes y MEF2C Nkx2.5. CVP se asemejan a los miocitos cardíacos basados ​​en los patrones de expresión de marcadores miocárdicos y cualidades estructurales y funcionales de ^3, lo que ofrece una gran promesa para los propósitos de tejidos cardíacos regenerativas.

Aunque ha habido muchos avances en el campo de la ingeniería de tejidos, imitando la arquitectura celular natal sigue siendo un desafío clave. Los métodos convencionales para hacer frente a este reto incluyen la siembra andamios biológicos o sintéticos con células in vitro. Debido a un número de desventajas de los andamios, incluyendo una rápida degradación, la estabilidad física y mecánica limitada y baja densidad celular ^1,4,5, hemos intentado diseñar andamios menos tejido. AltHough células cardiacas pueden modificar su microentorno local por la secreción de proteínas de matriz extracelular, que tienen una capacidad más limitada para organizarse a la varilla miocitos cardiacos con forma en la ausencia de señales extracelulares. Por lo tanto, una plantilla que proporciona células apropiadas señales espaciales y biológicos para componer el tejido miocárdico funcional se requiere. La impresión por microcontacto aborda este reto proporcionando una técnica sencilla y barata para controlar con precisión la forma celular, la organización y función ^6-8, todos los cuales son cruciales para la generación de alineado tejido miocárdico funcional. Comprende el uso de Microtexturados polidimetilsiloxano (PDMS) sellos con tamaños de las características que van a 2 micras ⁹ que permiten la deposición de proteínas de matriz extracelular sobre sustratos de PDMS en patrones precisos y por lo tanto afectar a la adhesión celular espacialmente.

En este documento, se propone combinar la tecnología de bioingeniería de tejidos con tallo cell biología para generar anisotrópico tejido miocárdico funcional. En consecuencia, aquí demuestran nuestro enfoque publicado recientemente por el siguiente: (1) la generación de superficies de las proteínas microestructurada en PDMS sustratos por impresión por microcontacto para la generación de un modelo de tejido de miocardio alineados, (2) el aislamiento de alta pureza a partir de progenitores cardíacos diferenciación de células ES in vitro, y (3) la combinación de ambas técnicas para generar alineado tejido miocárdico funcional.

Protocolo

El protocolo para generar alineado tejido miocárdico funcional se puede dividir en tres partes principales. La fabricación del maestro micropatterned utilizando técnicas litográficas blandas no se considera parte de la siguiente protocolo pero se puede hacer basado en el método establecido ^6.

1. Microcontacto impresión de fibronectina en PDMS Sustratos

1. Mezclar Sylgard 184 (Dow Corning) elastómero PDMS en una base de relación de 10:1 a curar agente y desgasificar el conjunto utilizando un desecador para eliminar las burbujas de aire.
2. Curar PDMS contra un maestro previamente fabricado con 20 micras de ancho y 2 crestas altas mu m, separadas por espaciamiento 20 micras, ya sea para 2 días a temperatura ambiente o 4 hr a 65 ° C para obtener Microtexturados Sellos de PDMS.

* El curado en un desecador es muy recomendable para eliminar las burbujas de aire.

3. Girar capa PDMS sobre cubreobjetos de vidrio (por ejemplo,22x22 mm) a 5.000 rpm durante 2 min utilizando una recubridora de rotación Avanza para producir fina y uniforme PDMS sustratos de espesor 15 micras.
4. Limpie sellos con etanol al 70% para eliminar el polvo y las partículas de suciedad. Deje secar al aire.

Sellos * Puede ser utilizado en varias ocasiones, sin embargo, la renovación de sellos de PDMS sobre una base regular es recomendado debido a una abrasión en la superficie con el tiempo.

5. Sellos de lugar en un limpiador de plasma SPI-Prep II de plasma y un proceso para 1 min a 275 mTorr para hacer superficies de PDMS hidrófilo.

* El oxígeno tratamiento de plasma deben ser observados. Los tiempos más largos de tratamiento puede dar lugar a la formación de grietas del elastómero.

6. Sellos de esterilizar con 70% de etanol durante 1 min. Secar rápidamente con aire comprimido.

* Otros pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad.

7. Cubra las superficies de sello con Fibronectin solución (50 mg / ml en ddH ₂ O). Dejar que se adsorben al menos 10 min.
8. Sacuda solución de fibronectina sellos y se secan rápidamente con el aire comprimido.
9. Establecer contacto conforme entre sellos y sustratos PDMS durante 2 minutos y presione firmemente.
10. Enjuague con sustratos micropatterned ddH ₂ O. Guárdelos en ddH ₂ O para un máximo de 2 semanas a 4 ° C, a menos inicialmente utilizado. Tienda PDMS sellos en ddH ₂ O.

2. Mantenimiento de dobles transgénicos Líneas de células madre embrionarias

Primero, prepare los siguientes medios para el cultivo de células madre embrionarias de ratón:

Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)-Medio: Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% suero bovino fetal (FBS) de células ES-o diferenciación de grado, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)

Células madre embrionarias (ESC)-Medio: DMEM, 15% FBS células ES-grado,1% no aminoácidos esenciales (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,0007% de 2-mercaptoetanol (2-ME)

1. Capa 6-y las placas con gelatina estéril al 0,1% en ddH ₂ O y se deja absorber 15 min a 37 ° C.
2. Añadir MEFs de una parte alícuota se descongeló a 50 ml de PBS en un tubo cónico y centrifugar de ellos a 1.000 rpm durante 5 min. Resuspender en MEFs MEF-medio plazo.
3. Después de la adsorción, aspirado exceso de gelatina y MEFs complemento en los pocillos. Permitir MEFs 1 día a adjuntar.

* Una alícuota de 10 millones de MEFs suficiente para 3 placas de 6 pocillos.

4. Cuando MEFs han unido, añadir las células ES a partir de una parte alícuota se descongeló a 50 ml de PBS en un tubo cónico y centrifugar de ellos a 1.000 rpm durante 5 min. Resuspender las células madre embrionarias en ESC-medio y agregar a los pocillos que contienen MEFs. Las células madre embrionarias en cultivo ESC-medio hasta que se alcanza la confluencia.

* Una vez que las células madre embrionarias han alcanzado la confluencia, los pases se required para evitar el crecimiento excesivo y mantener colonias de células ES.

5. Preparar las células madre embrionarias para pasajes. Aspirar ESC-medio y lavar una vez con PBS estéril.
6. Aspirar el PBS y se añaden 500 l de tripsina. Proceso de 3,5 min a 37 ° C.
7. Vierta la solución Tripsina arriba y abajo varias veces para romper las colonias de células ES y neutralizarla con 500 l de ESC-medio.
8. Passage células ES de acuerdo a su proporción deseada, por ejemplo, transferencia 33 l a otra así preparada previamente con MEFs paso a 1/30. Mantener las células madre embrionarias en ESC-Media.

* Una relación de paso de 1/30 permite que las células ES para la confluencia en 3 días. Las células madre embrionarias Pasaje de acuerdo a su horario de diferenciación in vitro.

3. Diferenciación in vitro de dobles transgénicos Líneas de células madre embrionarias y el aislamiento y siembra de células progenitoras cardíacas

En primer lugar, preparar el followimedios ng necesario para la diferenciación in vitro de células ES:

Adaptación-Medio: medio modificado de Dulbecco Iscove (IMDM), 15% FBS células ES de grado, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% de 2-ME

Diferenciación-Medio: IMDM, el 15% de SFB Diferenciación grado. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% de ácido ascórbico 0,1 M, 0,0007% de 2-ME

1. Iniciar la diferenciación in vitro cuando las células ES han llegado a la confluencia. Escudo 10 cm de platos de cultivo estéril con 0,1% de gelatina en ddH ₂ O y se deja adsorber 15 min a 37 ° C.

* Tenga en cuenta la duración del proceso de diferenciación in vitro en. Se tarda 8 días hasta progenitoras cardíacas pueden ser aislados. Planifique sus experimentos en consecuencia.

2. Cosecha de células madre embrionarias como antes. Después de la adsorción, el exceso de aspirado de gelatina y añadir aproximadamente 1.3 a 1.2 de la suspensión de células ES para cultivo preparadoplatos que contienen Adaptación y medio plazo. Células de cultivo durante 2 días.

* Seleccione la cantidad de células madre embrionarias para la adaptación de acuerdo a sus experimentos.

3. Cosecha adaptado células ES en un tubo cónico de 50 ml que contenía PBS utilizando 1. 5 ml de tripsina. Centrifugar las células disociadas ES a 1.000 rpm durante 5 min y se resuspenden en ellos Diferenciación-medio.
4. Hacer cuerpos embrioides (EB) de aproximadamente 1.000 células por 10 l gota en 15 cm de platos de cultivo usando una pipeta multicanal. Invertir las placas y EBS cultura como colgar gotitas durante 2,5 días a 37 ° C.
5. Después de 2,5 días, la piscina de EBs de 6-8 15 cm de platos de cultivo en un medio de diferenciación por medio-y cultivarlos durante otros 3,5 días a 37 ° C.
6. Después de 3,5 días, recoger embrioides en un tubo cónico de 50 ml y dejar que se hunden al fondo durante aproximadamente 5 min. Aspirar el sobrenadante y lavar EBS con PBS estéril. Vamos EBS hundirse de nuevo a la parte inferior de aproxoximately 5 min.
7. Disociar EBS mediante el procesamiento de ellos con 2. 5 ml de tripsina durante 2 min en un baño de agua a 37 ° C agitando suavemente el tubo. A continuación, agregue 2. 5 ml de PBS estéril a la solución de tripsina y pipetear arriba y abajo con una pipeta de 10 ml serológica aproximadamente 8-10 veces para romper los grupos de células. Neutralizar la tripsina con 10 ml de tampón FACS que contenía 7,5% de FBS células ES o diferenciación de grado y 0,01% en PBS DAPI.
8. Centrifugar disociado de EBs a 1.000 rpm durante 5 min y resuspender ellos en aproximadamente 1 ml de tampón FACS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml aproximadamente 8-10 veces para romper grupos de células.

* Añadir tampón FACS de acuerdo con la cantidad estimada de disociar EBS. Células demasiado concentrados pueden obstruir durante FACS y células concentradas demasiado bajas pueden prolongar el tiempo de FACS innecesariamente.

9. Transferir las células a un recipiente estéril de fondo redondo de tubo con un filtro de células 35 micras para obteneruna suspensión de células individuales.
10. Clasificar las células diferenciadas ES utilizando un citómetro de flujo FACSAria y obtener poblaciones purificadas de CVP.

* Se desarrolló una estrategia de puerta de varios pasos para aislar células altamente purificadas de colores. En resumen, primera puerta a la amplitud dispersión frontal (FSC-A) y la amplitud de dispersión lateral (SSC-A) (fig. 1A). Esto nos permite separar las células enteras a partir de los desechos celulares. A continuación, en la puerta de FSC-A y Forward Scatter-Ancho (FSC-W) (fig. 1B). Esto nos permite aislar células singletes de dobletes y otros agregados celulares. A continuación, en la puerta SSC-A y Side Scatter-Ancho (SSC-W) (Figura 1 C). Esto aumenta la pureza de singletes de células. A continuación, la puerta en la tinción DAPI para aislar células viables (DAPI-negativa) a partir de células no viables (Figura 1D). A continuación, la puerta en Phycoeryhthrin Amplitud (PE-A) y PE-colorante de cianina 7 Amplitud (PE-Cy7-A) para obtener cierto rojo-positivo (R ⁺ ) y verdaderos negativos en rojo (R ^- células) y para excluir autofluorescentes rojo-negativos células (Figura 1E). R ⁺ y R ^- células son luego cerrada por separado en amplitud con isotiocianato de fluoresceína (FITC-A) y PE-A para ordenar verdaderos verde-negativas (G ^-)-positivos verde (G ⁺⁾ y cierto células dentro de estas poblaciones (Figura 1F + 1G). Esto resulta en 4 poblaciones de células como sigue: R ⁺ G ^+, R ⁺ G ^-, R ^- G ⁺ y R ^- G ^- (Figura 1H).

11. Pasivar micropatterned sustratos con 1% de Pluronic F-127 en ddH ₂ O durante 10 min. Entonces, lávelos 3 veces con PBS estéril.

* Pluronic F-127 es un tensioactivo que bloquea la adhesión celular. Es compatible con el confinamiento de la adhesión celular a la superficie microestructurada.

12. Coloque juntas PDMS alrededor de la región modeladay presione firmemente. Entonces, las semillas de CVP en fibronectina sustratos micropatterned.

Resultados

FACS-purificación de células in vitro ES diferenciadas reveló cuatro poblaciones distintas de células progenitoras (Figura 1). La presencia de fibronectina microestructurada se confirmó por microscopía de inmunofluorescencia que muestra una transferencia completa de líneas continuas de fibronectina (Figura 2). Revestimiento de FACS-progenitores aislados en micropatrones fibronectina resultó en la alineación de la R ⁺ G ⁺ y parte de la R ^-

Discusión

En este protocolo, hemos presentado un método para aislar poblaciones purificadas de células progenitoras cardiogénico y sembrar en ellos micropatterned sustratos fibronectina lo que les permite alinear y dar un miocito cardíaco-como forma de bastón. Organización celular normal es crítica para la función del tejido normal de ^8,10, en particular para el tejido miocárdico. Los miocitos cardíacos se ha demostrado que desarrollar mecánica mejorada y propiedades electrofisiológicas ^{11,12 11,13} al formar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del Material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
L-ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544	Preparar una solución 0,1 M en ddH 2 O
Desecador de vacío de 10 pulgadas	Nova-Tech International, Inc.	55206
4 ',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI)	Life Technologies	D1306
Dulbecco Modificado Medio Eagle	Thermo Scientific	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
FACSAria II citómetro de flujo	BD Biosciences
Suero Bovino FetalDe células ES de grado	Gemini Bio-Productos	100-106
Suero Fetal Bovino Diferenciación de grado	Gemini Bio-Productos	100-500
Fibronectina de plasma bovino	Sigma-Aldrich	F4759	Solubilizar a 1 mg / ml en ddH 2 O
Fisherfinest premium cubierta del cristal 22x22mm	Fisher Scientific	12 a 548-B
Gelatina de piel porcina	Sigma-Aldrich	G1890	Preparar 0,1% de solución en ddH 2 O
Avanza recubridora de rotación	Avanza la investigación, Inc.	PWM32-PS-CB15
Medio modificado de Iscove Dulbecco	Thermo Scientific	SH30228.01
Factor inhibidor de leucemia	Yo-Preparó a partir de líneas celulares secretoras de LIF-		Preparar una solución madre 500 veces
MEM no aminoácidos esenciales	Gibco	11140-050
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Los fibroblastos de embriones de ratón	Cosechado a partir de embriones de ratón 12-15 días
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Preparar solución al 1% en ddH 2 O
Tubo de fondo redondo con 35 micras filtro de células	BD Biosciences	352235
SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner	SPI Supplies	11005-AB
SylgardKit de elastómero de silicona 184	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0,25% de tripsina-EDTA	Gibco	25200-056
Vacuum Gauge	SPI Supplies	11019-AB