La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.
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Artículo de método
Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios
En este artículo
Resumen
Resumen
MiRNAs estables están presentes en todos los fluidos corporales y algunos miRNAs circulantes están protegidos de la degradación por secuestro en pequeñas vesículas llamadas exosomas. Los exosomas pueden fusionarse con la membrana plasmática que resulta en la transferencia de ARN y proteínas a la célula diana. Sus funciones biológicas incluyen la respuesta inmune, la presentación de antígenos, y la comunicación intracelular. Entrega de miRNAs que pueden regular la expresión génica en las células receptoras a través de la sangre ha abierto nuevas vías para la intervención de destino. Además de ofrecer una estrategia para la administración de fármacos o agentes terapéuticos de ARN, contenido exosomal pueden servir como biomarcadores que pueden ayudar en el diagnóstico, la determinación de las opciones de tratamiento y el pronóstico.
Aquí vamos a describir el procedimiento para el análisis cuantitativo de miRNAs y ARN mensajeros (ARNm) a partir de exosomas secretados en la sangre y de los medios de cultivo de células. Exosomas purificados se caracterizaron mediante análisis de Western blot para exosmarcadores Omal y PCR para ARNm de interés. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y inmunomarcaje se utilizan para validar la morfología y la integridad exosomal. Total de ARN se purificaron a partir de estos exosomas para asegurar que se puede estudiar tanto mRNA y miRNA de la misma muestra. Después de validar la integridad del ARN por Bioanalyzer, vamos a realizar una producción de PCR cuantitativa en tiempo real medio (qPCR) para identificar los genes miARN exosomal utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) cartas y estudios de expresión génica de las transcripciones de interés.
Estos protocolos pueden utilizarse para cuantificar los cambios en los miRNAs exosomal en pacientes, modelos de roedores y medios de cultivo de células antes y después de la intervención farmacológica. Contenido exosomal varían debido a la fuente de origen y las condiciones fisiológicas de las células que secretan exosomas. Estas variaciones pueden dar una idea de cómo las células y los sistemas de lidiar con el estrés o perturbaciones fisiológicas. Nuestros datos representativos muestran variations en miRNAs presentes en los exosomas purificados a partir de sangre de ratón, sangre humana y los medios de cultivo de células humanas.
Aquí vamos a describir el procedimiento para el análisis cuantitativo de miRNAs y ARN mensajeros (ARNm) a partir de exosomas secretados en la sangre y de los medios de cultivo de células. Exosomas purificados se caracterizaron mediante análisis de Western blot para detectar marcadores exosomal y PCR para ARNm de interés. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y inmunomarcaje se utilizan para validar la morfología y la integridad exosomal. Total de ARN se purificaron a partir de estos exosomas para asegurar que se puede estudiar tanto mRNA y miRNA de la misma muestra. Después de validar la integridad del ARN por Bioanalyzer, vamos a realizar una producción de PCR cuantitativa en tiempo real medio (qPCR) para identificar los genes miARN exosomal utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) cartas y estudios de expresión génica de las transcripciones de interés.
Estos protocolos pueden utilizarse para cuantificar los cambios en los miRNAs exosomal in los pacientes, los modelos de roedores y medios de cultivo de células antes y después de la intervención farmacológica. Contenido exosomal varían debido a la fuente de origen y las condiciones fisiológicas de las células que secretan exosomas. Estas variaciones pueden dar una idea de cómo las células y los sistemas de lidiar con el estrés o perturbaciones fisiológicas. Nuestros datos representativos muestran variaciones en miRNAs presentes en exosomas purificados a partir de sangre de ratón, sangre humana y de los medios de cultivo de células humanas
Introducción
MiRNAs no codificantes cortos modulan la expresión de genes mediante la unión al ARNm diana. Semilla complementariedad de secuencia de ~ 7 pares de bases permite a los genes miARN para unirse al ARNm diana que resulta en la inhibición de la traducción o en la reducción en la estabilidad del ARNm, ambos de los cuales pueden resultar en una disminución de expresión de la proteína diana 1. Las investigaciones realizadas durante la última década se ha demostrado de manera inequívoca un papel fundamental para los miRNAs en la mediación de las funciones celulares. También ha habido un considerable esfuerzo dirigido hacia la disección de los genes miARN cambios moleculares que subyacen a diversas enfermedades mediadas por 2,3. Por otra parte, la reciente identificación de miRNAs estables en los fluidos corporales 4-6 allanó el camino para su uso como nuevos biomarcadores susceptibles de diagnóstico clínico.
Un medio de transporte miRNA en los líquidos corporales es a través de los exosomas, pequeñas vesículas que transportan los ARNm, proteínas, mediadores lipídicos, y miRNAs a las células receptoras a través de la sangre circulante sistémica7-14 de iones. Esto resulta en la modulación de la expresión génica en las células receptoras y representa un nuevo mecanismo de comunicación celular. Por ejemplo, las células pueden modular procesos de inmuno-reguladoras mediante la secreción y / o absorbentes de exosomas que contienen biomoléculas implicadas en la inflamación tales como la interleuquina-1β (IL1), factor de necrosis tumoral-α (TNF), factor de crecimiento transformante-β5 (TGFβ5), y los miRNAs que regulan estos genes 13. Como los genes miARN expresión aberrante es una característica común en una variedad de enfermedades humanas, estas moléculas ofrecen nuevas oportunidades para el descubrimiento y validación de nuevas dianas terapéuticas 2.
MiRNAs circulantes están presentes en todos los fluidos corporales y se sabe que la composición de los exosomas es diferente en función de las celdas de origen de donde fueron liberados. Por lo tanto ofrecen una vía para estudiar el estado fisiológico de las células y cómo las células alteran la señalización inclusots en respuesta al estrés incluyendo enfermedades. El estudio de las alteraciones en la composición exosome puede dar una idea de la transducción de señales e investigar su posible utilidad como biomarcadores o vías de intervención terapéutica.
Aquí vamos a demostrar la purificación de los exosomas de múltiples fuentes basadas en protocolos publicados. Estos exosomas serán utilizados para el aislamiento de ARN seguido por qPCR para identificar y medir los niveles de miRNAs presentes en los exosomas.
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Protocolo
Todos los experimentos con muestras de sangre de humanos y roedores fueron ejecutados en cumplimiento de todas las normas, reglamentos y las agencias reguladoras. Los sujetos humanos se inscribieron después de dar su consentimiento informado aprobado por la Drexel University College de la Junta de Revisión Institucional de la medicina y los procedimientos de los estudios realizados con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional de Drexel y el empleo Comisión.
1. La purificación Exosome de sangre (~ 5,5 h)
CONSEJOS
- Nos Resuspender exosomas de un tubo de sangre (~ 10 ml de sangre humana y ~ 2 ml de sangre del ratón) en 300 l de ARN tampón de lisis del kit de aislamiento de los genes miARN mirVana.
- Para purificar exosomas de medios de cultivo celular, el medio se centrifugó a 500 xg durante 10 min para eliminar las células y también se filtra a través de un filtro de 0,22 micras después de la centrifugación a 12.000 x g. La purificación de exosomas de medios de cultivo celularno requiere una dilución en PBS, el lavado con PBS o el segundo paso ultracentrifugación.
- Si se utilizan los exosomas purificados para los estudios de proteómica, la adición de una etapa de centrifugación en gradiente de sacarosa tras la etapa de ultracentrifugación se reducirá la cantidad de agregados de proteínas y contaminantes 15.
- La morfología observada de exosomas puede diferir dependiendo de la fuente y los pasos de procesamiento para TEM. No se observó la morfología en forma de copa de exosomas que se ha atribuido previamente a las diferencias en el procesamiento de muestras 9,15. Nuestras imágenes de TEM, incluyendo la caracterización inmuno son similares a los anteriores informes de diferentes fuentes, incluyendo sangre, biliar y la cultura cortical exosomas derivados 9,16,17.
- Invierta el tubo recubierto EDTA que contiene el 5x y lugar de sangre en posición vertical a temperatura ambiente durante 10 a 60 min.
- Centrifugar a 2000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Recoger la capa superior, el plasma, en tubos de 15 ml y mantener en hielo.
- Diluir fluido con un volumen igual de PBS. Centrifugar 30 minutos a 2000 xg a 4 ° C.
- Transferir a tubos de centrífuga, añadir 1X PBS para un volumen total de 24 ml, y se centrifuga 45 min a 12.000 xg a 4 ° C.
- Traslado al ultracentrifugar tubos y centrifugar 2 horas a 110.000 xg a 4 ° C.
- Resuspender el pellet en PBS y centrifugar 1 hora a 100.000 xg a 4 ° C.
- Resuspender el sedimento en tampón apropiado (tampón de lisis de ARN).
- Volver a suspender en tampón PBS o RIPA para microscopía electrónica y análisis de transferencia Western, respectivamente.
2. Purificación de ARN utilizando un kit de aislamiento de los genes miARN mirVana Modificado (~ 1 hora)
CONSEJOS
- Prepare el área para aislar ARN mediante el uso de equipo de protección personal (PPE), limpiar las superficies y pipetas con RNasa Zap, y el uso de puntas con filtro estériles y tubos. Aunque el protocolo del proveedor da la opción de purificar sólo miRNA, siempre nos aislamos ARN total como mRNA y Mirna para que podamos estudiar tanto de la misma muestra.
- Adición de una etapa de tratamiento con DNasa en columna elimina los rastros de ADN que pueden estar presentes. Dependiendo de la fuente de exosomas, el ADN ha sido informado de que se ausente en exosomas purificados a partir de algunas fuentes, incluyendo ratón y líneas de células cebadas humanas 8, pero las secuencias de ADN cromosómicas han sido detectados en exosomas purificados a partir de cultivos de cardiomiocitos de los medios de comunicación 18.
- Hemos reducido el volumen de solución de lavado 1 a 350 l (Paso 2.4 a continuación) debido a que el proveedor proporciona sólo lo suficiente Solución de lavado 1 para uno 700 l adición. Si no se reduce el volumen no es suficiente solución de la izquierda para el uso de todo el contenido del kit. Pasos restantes se realizaron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
- Añadir 1/10 voLume de los genes miARN Aditivo homogeneizado (30 l) y se incuba en hielo durante 10 min.
- Se extrae con un volumen de ácido-fenol: cloroformo igual al volumen inicial de lisado. Centrifugar y recuperar la fase superior en un tubo nuevo.
- Añadir 1,25 volúmenes de 100% de etanol (375 l). Vortex. Aplicar filtro de cartucho y centrifugar 15 segundos a 10.000 x g.
- Añadir la mitad de la recomendada volumen miRNA Wash Solution 1 (350 l) y centrifugar 15 segundos a 10.000 x g.
- Añadir 10 l de DNasa 1 a 70 l de tampón RDD (Qiagen) para cada muestra. Añadir 80 l a la columna y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir la solución de lavado 1 (350 l) y centrifugar 15 segundos a 10.000 x g.
- Añadir la solución de lavado 2/3 (500 l) y centrifugar 15 seg a 10.000 x g. REPETIR.
- Eluir con 40 l 95 ° C libre de nucleasa H 2 O.
- Determinar la concentración de ARN y diluir los ARN a 100 ng / l.
3. miARN perfiles de exosomas de Blood Utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) Tarjetas (~ 6,5 h)
CONSEJOS
- Prepare el área para aislar ARN mediante el uso de PPE, limpiar las superficies y pipetas con RNasa Zap, y el uso de puntas con filtro estériles y tubos.
- Se recomienda el paso de pre-amplificación (pre-amp) de 1-350 ng RNA (350-1,000 ng muestras no requieren etapa de pre-amplificador después de la síntesis de ADNc). Es importante determinar si el pre-amplificador es necesario para la muestra, ya que debe tratar a todas las muestras en condiciones de igualdad. Etapa Pre-amp añade costos y los valores de Ct tener una de corte aceptable más bajo (32 en lugar de 40).
- Es útil para preparar la reacción de ADNc en tiras de tubos en lugar de una placa en función del número de tarjetas que se pueden ejecutar en un solo día. Esto minimizará la congelación y descongelación de las muestras de cDNA que no se pueden procesar en el mismo día.
- Los exosomas recogidos de diferentes fuentes tienen difealquilar cantidades de ARN. Este protocolo permite que un máximo de 3 l molde de ARN para la reacción de síntesis de ADNc. Dependiendo de la fuente, la cantidad de ARN exosomal que se puede aislar tal vez limitado. Mientras que un tejido típico daría suficiente RNA cDNA que se harían a partir de 100 ng de ARN en 3 l de volumen, exosomas de la sangre humana o de los medios de cultivo de células humanas a menudo contienen menos de RNA y cDNA se debe hacer a partir de material de partida menos. Exosomas sangre de ratón contienen niveles más altos de ARN y al menos 100 ng en 3 l se pueden obtener.
- Para preparar ADNc a partir de ARN utilizando Pools Megaplex purificada transcriptasa inversa primers (Grupo A y Grupo B contienen cebadores para los miRNAs en las tarjetas de microfluidos Array A y B), descongelar los componentes de la reacción en hielo.
- Label dos tubos ml RNasa libre de 1,5 para la reacción RT con Piscina A primers o cebadores Grupo B y agregar componentes a fin gráfico. Añadir al menos un volumen extra de componentes para 2 o más reacciones o hacer una mezcla maestra según lo recomendado por tque vendedor.
| Componente reacción de RT | Componente Concentración | Volumen de muestra 1 (total de V / muestra = 4,5 l) |
| Agua libre de nucleasa | 0,20 l | |
| RT buffer Megaplex (10 veces) | 1X | 0,80 l |
| dNTPs (100 mM) | 4,4 mM | 0,20 l |
| MgCl2 (25 mM) | 5 mM | 0,90 l |
| RNasa Inhibidor (20U/μl) | 2 U | 0,10 l |
| Megaplex RT cebadores A o B (10X) | 1X | 0,80 l |
| MultiScribe de transcriptasa inverso | 75 U | 1,50 l |
- Invertir tubos de 6 veces y cientorifuge brevemente. Entonces, una pipeta 4,5 l mezcla de reacción de RT en MicroAmp Tiras de 8 tubos o un plato de reacción óptica de 96 pocillos MicroAmp.
- Añadir 100 ng de RNA y ajustar el volumen de 3 l de agua tratada con DEPC o añadir 3 l de ARN total, revuelva con la punta de la pipeta, y sellar los tubos o placas. Girar brevemente e incubar en hielo durante 5 min.
- Cargue la reacción en la máquina PCR y ejecutarla en las condiciones siguientes (según lo recomendado por el protocolo Biosystems Pools Megaplex Aplicada):
| Etapa | Temperatura | Tiempo |
| Ciclo (40x) | 16 ° C | 2 min |
| 42 ° C | 1 min | |
| 50 ° C | 1 seg | |
| Sostener | 85 ° C | 5 min |
| Sostener | 4 ° C | ∞ |
- Guarde cDNA a -20 ° C (bueno por lo menos una semana) o seguir paso pre-Amp que se puede almacenar durante una semana.
- Descongele primers preamplificador para el Grupo A y el Grupo B en el hielo e invierta para mezclar. Remolino Taqman Pre-Amp Master Mix y mantener en hielo también.
- Siga la tabla añadiendo al menos un volumen extra de componentes para 2 o más reacciones o hacer una mezcla maestra según lo recomendado por el proveedor.
| Componente Reacción Pre-Amp | Volumen de muestra 1 |
| Agua libre de nucleasa | 7,5 l |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2X) | 12,5 l |
| Primers preamplificador Megaplex A o B (10 veces) | 2,5 l |
- Pipetear 2,5 l RT product en MicroAmp tiras 8-tubo o una placa de reacción óptica de 96 pocillos MicroAmp y dispensar 22,5 l de la mezcla de reacción PreAmp en cada pocillo.
- Tapar la placa e incubar en hielo 5 min y luego cargar la muestra en la máquina de PCR. Ejecutar en las siguientes condiciones.
| Etapa | Temperatura | Tiempo |
| Sostener | 95 ° C | 10 min |
| Sostener | 55 ° C | 2 min |
| Sostener | 72 ° C | 2 min |
| Ciclo (12x) | 95 ° C | 15 seg |
| 60 ° C | 4 min | |
| Sostener | 99,9 ° C | 10 min |
| Sostener | 4 ° C | ∞ |
- Después de que se terminó la reacción preamplificador, centrifugar brevemente los tubos o la placa y a continuación, añadir 75 l 0,1 X TE pH 8,0 a cada pocillo o tubo.
- Selle y mezclar y centrifugar brevemente. Almacenar el producto diluido durante una semana a -20 ° C o continuar para cargar el plato.
- Combina lo siguiente en un tubo de 1,5 ml RNasa libre de hielo.
| Componente | Volumen 1 de la tarjeta |
| TaqMan PCR Universal Master Mix, No AmpErase UNG (2X) | 450 l |
| Producto diluido preamplificador | 9 l |
| Agua libre de nucleasa | 441 l |
- Invierta el tubo para mezclar y centrifugar brevemente. Dispensar 100 l de la mezcla de reacción de PCR en cada puerto de la tarjeta de matriz de microARN Taqman.
- Se centrifuga la tarjeta de 2 x 1000 g durante 1 min. Sellar la tarjeta y ejecutarlo usando la plantilla proporcionada con los iniciadores del manual de Applied Biosystems y así bajo la configuración de matrices de densidad 384 Taqman. Utilizamos Applied Biosystems 7900HT Fast System PCR en tiempo real.
4. Análisis de ARNm por Taqman (~ 1,5 h)
- Para preparar reacción qPCR, mezclar los componentes de la reacción en el orden en el gráfico. Todas las muestras se analizaron con sondas de cebadores para el gen de interés, así como ARNr 18S como el gen normalizador.
| Taqman componente de reacción | Volumen de muestra 1 |
| Agua libre de nucleasa | 7 l (ajuste sobre la base de la muestra individual) |
| Taqman rápida Master Mix (2X) | 10 l |
| Primer sondas Taqman (20x) | 1 l |
| ADNc a partir de 100 ng de ARN | 2 y mu; L (ajustar sobre la base de la muestra individual) |
- Ejecutar la placa de 96 pocillos usando el rápido bloque de 96 pocillos como se recomienda por el fabricante (Biosystems 7900HT Fast sistema de PCR en tiempo real Aplicada).
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Resultados
Después de aislamiento de exosomas de la sangre o los medios de cultivo de células, la pureza de los exosomas puede ser probado por microscopía electrónica (EM) y western blot (Figuras 1A y 1B). Se confirmó nuestras preparaciones de exosoma de diversas fuentes con EM y Western blot utilizando anticuerpos múltiples. Figura 1A muestra EM imágenes que confirma que los exosomas son intacta, con un diámetro de ~ 30 -100 nm y contienen CD81 por medio del etiquetado inmunomarc...
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Discusión
En este protocolo, se muestra la cuantificación de miRNAs y mRNAs de exosomas purificados por centrifugación diferencial a partir de la sangre y los medios de cultivo. Los exosomas tienen diversos componentes que dependen de su origen y están implicados en un número de funciones biológicas, incluyendo la respuesta inmune, la presentación de antígenos, la comunicación intracelular, y la transferencia de ARN y proteínas 9,11,12,19,20. Aunque el tamaño y la forma es un factor determinante de la pureza exosome, u...
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Divulgaciones
Los autores tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por fondos de subvención de la Fundación Rita Allen a Seena Ajit. Los autores desean agradecer a Erika Balogh y el Dr. Soumitra Ghoshroy de la Universidad de Carolina del Sur Centro de Microscopía Electrónica para el uso de instrumentos, la asistencia científica y técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vacutainer recubierto de EDTA (tubos de 10 ml) | BD Diagnostics | 366643 | Para la purificación de exosomas a partir de sangre humana |
| Vacutainer recubierto de EDTA (tubos de 2 ml) | BD Diagnostics | 367841 | Para la purificación de exosomas a partir de sangre de ratón Tubo de |
| ARN sanguíneo PAXgene | BD Diagnostics | 762165 | Para el aislamiento de miARN de sangre total Kit de |
| aislamiento de microARN miRVana | Ambion | AM1561 | |
| Ácido-fenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | para tarjetas TLDA |
| Megaplex RT roedor Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamplificador roedor set de piscina v3.0 | Applied Biosystems | ||
| Taqman Array Juego de MicroARN para roedores A+B V3.0 | 4444909 | ||
| humana Megaplex RT de Applied Biosystems V3.0 | Applied Biosystems | ||
| v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array para microARN humano v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman Kit MicroRNA RT | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Mezcla maestra de PCR universal rápida Taqman | 4366072 de Applied Biosystems | qRT-PCR de ARNm | |
| (sonda de cebador) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Factor de crecimiento endotelial vascular A (sonda de cebado) | Maxima de Applied Biosystems | ||
| Kit de síntesis para RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | Para ARNm |
| Anticuerpo HSP70 | Abcam | ab94368 | Para Western blot |
| Anti-conejo IgG-Gold | Sigma | G7402 | Para microscopía electrónica |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Níquel 300 malla de carbono Rejillas de formvar | Ciencias de la Microscopía Electrónica | FCF300-Ni | |
| Rejillas de cobre 300 mesh carbon formvar | Ciencias de la Microscopía Electrónica | FCF300-Cu | |
| Table 1. Tabla de reactivos específicos. |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
