Demostramos cómo realizar macrófagos RM con contraste superparamagnético ultra pequeño (USPIO) en la artritis séptica, lo que permite una inicial y longitudinales In vivo Evaluación no invasiva de la infiltración de macrófagos y una evaluación de la eficacia de la terapia.
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Artículo de método
En vivo los macrófagos de imágenes utilizando MR Agente de contraste dirigida para la Evaluación Longitudinal de Artritis séptica
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Resumen
Resumen
Los macrófagos son células clave en la iniciación, el desarrollo y la regulación de la respuesta inflamatoria a la infección bacteriana. Los macrófagos son intensamente y cada vez reclutados en las articulaciones sépticas de las fases tempranas de la infección y la infiltración se supone que retroceder una vez que se obtiene la eliminación eficaz de los agentes patógenos. La capacidad de identificar en la actividad de los macrófagos in vivo en una articulación infectada por lo tanto, puede proporcionar dos aplicaciones principales: la detección temprana de la sinovitis aguda y el seguimiento de la terapia.
En la detección no invasiva in vivo de los macrófagos se puede realizar con imágenes de resonancia magnética usando nanopartículas de hierro, tales como óxido de hierro superparamagnético ultra pequeño (USPIO). Después de la administración intravascular o intraarticular, USPIO están específicamente fagocitado por los macrófagos activados, y, debido a sus propiedades magnéticas, inducir cambios de señal en los tejidos que presentan infiltración de macrófagos. A quantitativEvaluación de correo del infiltrado es factible, como el área con pérdida de señal (número de píxeles oscuros) observó en eco de gradiente imágenes de RM después de inyección de partículas se correlaciona con la cantidad de hierro en el tejido y por lo tanto refleja el número de células USPIO-cargados.
Se presenta aquí un protocolo para realizar las imágenes de macrófagos utilizando USPIO-mejorada imágenes de RM en un modelo animal de artritis séptica, lo que permite una inicial y longitudinal en la evaluación no invasiva in vivo de la infiltración de macrófagos y una evaluación de la acción de la terapia.
Introducción
Formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) se considera que es la modalidad de imagen de elección para la demostración de la sinovitis infecciosa debido a su alta resolución espacial y contraste de los tejidos blandos. Los cambios de señal observadas en la RM en la artritis baja T1 y de alta señal en T2 que refleja el aumento de la presencia de contenido de agua extracelular, y una marcada mejora después de la administración del agente de contraste basado en gadolinio, en consonancia con las conclusiones histológicamente de aumento de la vascularización debido a la vasodilatación y angiogénesis 1. Sin embargo, la RM es a menudo incapaz de demostrar resolución de la infección durante la terapia con antibióticos como realce persistente se puede observar en las articulaciones de pacientes con curado clínicamente y biológicamente artritis séptica debido a la persistencia del espacio extracelular ampliada (tejido de granulación, la cicatriz fibrótica) 2. Además de los cambios extracelulares, células inflamatorias, incluyendo un intenso reclutamiento de macrófagos se infiltran de forma masiva en lainfectados sinovial. Los macrófagos juegan un papel importante tanto en la fase aguda y crónica de la infección bacteriana 3. Inducen la reacción inflamatoria requerida para erradicar los microorganismos patógenos, y coordinar la resolución de la inflamación, como la inflamación inducida por macrófagos persiste mientras tejidos necróticos no se eliminan, la prevención de reparación para comenzar 4. Por lo tanto, la reducción de la infiltración de macrófagos dentro de sinovia infectada después de la terapia eficaz puede ser un indicador fiable de la resolución de la infección. Celular de imagen es capaz de demostrar la infiltración celular específica dentro del tejido patológico. Específico de macrófagos RM usando dirigido agente de contraste ha sido ampliamente investigado y ha demostrado su capacidad para demostrar la inflamación o infección 5-7 conjunta. Después de la inyección intravenosa, tales agentes de contraste dirigidos, tales como partículas de USPIO (óxidos de hierro superparamagnético ultra pequeños) son absorbidos por las células fagocíticas, tales como macrófagos y,debido a sus propiedades magnéticas, inducir cambios de señal en los tejidos que presentan infiltración de macrófagos 8. El seguimiento longitudinal de los cambios en la terapia de señal de RM permite una en la evaluación no invasiva in vivo de la infiltración de macrófagos, y una reducción de USPIO-macrófagos cargados cambios de señal relacionados demostraría éxito de la terapia. El propósito de este informe es presentar la forma de realizar los macrófagos RM no invasiva para controlar la artritis séptica, demostrando la reducción de la infiltración de macrófagos en el líquido sinovial.
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran temas de los animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Atención Animal Hospital Universitario.
1. La inoculación bacteriana intraarticular
- Antes de la inyección, anestesiar a los conejos por medio de inyección intramuscular de ketamina (30 mg / kg de peso corporal) se mezcla con xilazina (4 mg / kg) dentro de músculo erector Spinae. Asegúrese de animales son completamente anestesiados por la comprobación de que no responden a pinch pata. Este protocolo proporciona anestesia suficiente para la inyección intraarticular de la articulación de la rodilla. Coloque los animales bajo la máscara de oxígeno durante la anestesia.
- Afeitado rodilla animales. Preparar la rodilla para inyección aséptica por 3 paños alternados de matorral povidona yodada y alcohol seguido de la aplicación de la solución de povidona yodada.
- Identificar manualmente el tendón rotuliano como una estructura elástica en la cara anterior de la rodilla usando una tapa de la aguja estéril como se muestra o una sonda estéril.
- Con el control visual y por vía anterior, coloque una aguja de 25 G por vía percutánea en la rodilla derecha de cada uno de los 12 conejos a través del tendón rotuliano.
- Inyectar cada rodilla con 1 ml de una suspensión bacteriana de Staphylococcus aureus (cepa Neumann) a una concentración de 10 6 UFC / ml. Una inyección sin resistencia confirma la ubicación intra-articular de la punta de la aguja.
- Después de los procedimientos de inyección, mantener al animal bajo la fuente de convección para evitar la pérdida de calor y controlar la frecuencia respiratoria mediante la observación de movimiento del pecho. Una vez despierto, mantener a los animales en jaulas con acceso libre a comida y agua.
- Controlar el dolor mediante la administración de una inyección intramuscular de 0,1 mg / kg de buprenorfina cada 8 h.
- Clínicamente observar conejos cada día, control de las cantidades consumidas de los alimentos y el agua, la pérdida de peso, la temperatura, y el comportamiento general.
- Para la imagen de la fase aguda de la infección por realizar la primera sesión de imágenes MR tan prontocomo un animal presenta pérdida de peso sustancial (10%); generalmente esto ocurre después de aproximadamente 2 días.
- Si se requiere la administración del fármaco por vía intravenosa antes de examen de resonancia magnética, un acceso venoso auricular podrá ser instalado (véase más adelante).
2. El examen MRI
Cuando los animales imágenes en vivo, una instalación de cuidado de los animales es un elemento clave para garantizar la comodidad del animal y de la anestesia óptima. Esto permitirá que para obtener los mejores resultados de imagen y asegurar una adquisición de la imagen de reproducción para los estudios longitudinales. Debido al tamaño del animal, el uso de una unidad de MR clínico de tamaño (1,5 T o T 3) es la más adecuada. 8-canal de bobina de rodilla clínica se utiliza, ya que proporciona una resolución adecuada y relación de contraste-a-ruido para la exploración de la rodilla del conejo.
- Antes de la instalación en el sistema de imagen, instale un acceso venoso periférico a través de una vena auricular. Este acceso servirá para inyectar el agente de contraste.
- Afeitado y desinfectar el oído.
- Realice el anestesia local mediante inyección subcutánea de lidocaína.
- Inserte un G catéter 25 dentro de la vena auricular lateral.
- Evaluar la permeabilidad mediante la inyección de 1 ml de suero fisiológico estéril.
- Mantener el catéter con tapping adhesivo.
- Anestesiar a los animales por medio de inyección intramuscular de ketamina (30 mg / kg de peso corporal) se mezcla con xilazina (4 mg / kg). Los animales son totalmente anestesiado, una vez que no responden a pinch pata. Coloque una máscara facial en el conejo, dándole oxígeno con una velocidad de flujo de 200 ml / min.
- Una vez que esté anestesiado, tener animales en la unidad de RM. Coloque los animales de modo que las rodillas se encuentran en el centro de la bobina de MR. Colocar las patas de los animales en extensión completa, de modo que el eje largo de la tibia es paralelo a la mesa de unidad de imágenes de RM. Utilice cierres de velcro o bolsas de arena para mantener la posición óptima de la pierna.
- Monitoreo Cardio-respiratoria de los animales no se requiere que elprotocolo de anestesia permite anestesia profunda en la respiración espontánea, pero los animales tienen que ser cubiertos para evitar la pérdida de calor inducida por la anestesia.
- MR protocolo se detalla en la Tabla 1. El tiempo promedio para la adquisición total, incluyendo una instalación óptima es de aproximadamente 20 min.
- Realizar la RM en planos diferentes. Sin embargo, el plano transversal de las rodillas (ortogonal a la tibia) es el plano de referencia, ya que garantiza la reproducibilidad de la posición de la imagen anatómica para los exámenes longitudinales secuenciales y permite la correlación óptima con las rebanadas histológicos.
- En la realización de secuencias sin contraste, inyectar el agente de contraste UPSIO a través del acceso venoso auricular. Lentamente administrar las partículas de óxido de hierro en una dosis única de 150 mol de Fe / kg. Enjuague el catéter por la inyección de 1 ml de suero fisiológico estéril.
- Repita el mayor GRE ponderada secuencia 24 horas después de la inyección. Este retardo permite que las partículas sean fagocitadas por loslos macrófagos.
- Para los estudios longitudinales que evalúan fármacos efecto (antibióticos, esteroides, anticuerpos anti-macrófagos, etc.), Repita las pruebas de RM secuenciales utilizando el protocolo descrito anteriormente.
3. Análisis de Imagen
- Para la evaluación longitudinal de realizar mediciones en el mismo nivel anatómico, y definir un punto de referencia fácilmente identificable. Por ejemplo, la adquisición a través del plano axial donde se observa el mayor diámetro de la rótula es una forma segura de obtener mediciones reproducibles (Figura 1).
- Realizar análisis de imágenes usando un software DICOM basado (como Osirix) o un software de procesamiento de imágenes (ImageJ).
- El uso de software ImageJ, realizar la segmentación de la zona sinovial que demuestra la pérdida de señal USPIO-mejorada GRE imagen ponderada en T2 utilizando la herramienta de dibujo "irregulares área" en la. Una vez que la membrana sinovial con señal oscura se describe, haga clic en "Analizar" para obtener el área /número de píxeles (Figura 2).
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Resultados
En las imágenes sin contraste, la membrana sinovial de las rodillas infectadas presenta una inflamación difusa de la señal intermedia que no es distinguible del tejido blando circundante, mientras que el fémur y la rótula aparecen como estructuras de señal bajos (Figura 1).
En las imágenes USPIO-mejoradas, 24 horas después de la administración del agente de contraste, el área sinovial que contiene macrófagos cargados de USPIO demostrará la pérdida de señal (Figuras 1...
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Discusión
Mientras que los agentes de contraste a base de gadolinio no específicos proporcionan información sobre el volumen y la perfusión del espacio extracelular, los macrófagos formación de imágenes por MR USPIO-mejorada permite una localización anatómica precisa y una evaluación cualitativa de la infiltración de macrófagos dentro sinovial infectada sin la necesidad de tomar muestras de tejido 9. Debido a su alta sensibilidad, USPIO puede demostrar incluso sutil infiltrado celular presentes en las primeras fases de...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos sinceramente a F. Bierry de asistencia en la producción y edición de video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo/material | Número | catálogo | Comentarios |
| P904 | Guerbet | Dosis: 150 μ mol Fe/kg | |
| Ketamina (500 mg/ml ketamina) | Virbac | Dosis: 30 mg/kg | |
| Rompun (20 mg/ml Xilacina) | Axience | Dosis: 4 mg/kg | |
| Buprenorfina | Vetoquinol | Dosis: 0,1 mg/kg/8 h | |
| BD 22 G, 1 pulgada | BD Biosciences | 381423 | |
| BD 25 G, 5/8 pulgadas | BD Biosciences | 305122 |
Referencias
- Madri, J. Inflammation and healing. Anderson's Pathology. Kissane, J. , 67-110 (1990).
- Sephel, G., Woodward, S. Repair, regeneration, and fibrosis. Rubin's Pathology. Rubin, R., Strayer, D. , 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. 71-98 (2008).
- Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of macrophages in Staphylococcus aureus-induced arthritis and sepsis. Arthritis Rheum. 43 (10), 2276-2282 (2000).
- Heale, J., Speert, D. Macrophages in bacterial infection. The Macrophage. Burke, B., Lewis, C. , Oxford University Press. Oxford, England. 210-252 (2008).
- Bierry, G., et al. Macrophage activity in infected areas of an experimental vertebral osteomyelitis model: USPIO-enhanced MR imaging--feasibility study. Radiology. 248 (1), 114-123 (2008).
- Bierry, G., et al. MRI of macrophages in infectious knee synovitis. AJR Am. J. Roentgenol. 194 (6), W521-W526 (2010).
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- Sigovan, M., et al. Rapid-clearance iron nanoparticles for inflammation imaging of atherosclerotic plaque: initial experience in animal model. Radiology. 252 (2), 401-409 (2009).
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Reimpresiones y permisos
