Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

15.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/50329

⸱

2 de abril de 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago , 2Department of Anesthesiology, University of Illinois at Chicago

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Resumen

La interacción de las plaquetas activadas y leucocitos (principalmente neutrófilos) en el endotelio activado trombosis media y la inflamación vascular. 1,2 Durante la formación de un trombo en el sitio de la lesión arteriolar, las plaquetas adherentes al endotelio activado y proteínas subendoteliales matriz de soporte de rodadura de neutrófilos y la adherencia. 3 A la inversa, bajo venulares condiciones inflamatorias, neutrófilos adherentes al endotelio activado puede soportar la adhesión y acumulación de plaquetas circulantes. Heterotípicos plaquetas agregación de neutrófilos requiere procesos secuenciales por las interacciones con los receptores específicos de receptor-contador entre las células. 4 Se sabe que las células endoteliales activadas liberan moléculas de adhesión tales como el factor de von Willebrand, iniciando así la adhesión de las plaquetas y la acumulación bajo condiciones de alto cizallamiento. 5 Además, células endoteliales activadas soporte rodante de neutrófilos y la adhesión por selectinas que expresan unmolécula-1 d adhesión intercelular (ICAM-1), respectivamente, en condiciones de bajo cizallamiento. 4 de plaquetas P-selectina interactúa con los neutrófilos a través de P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induciendo de ese modo la activación de neutrófilos β2 integrinas y firmes adhesión entre dos tipos de células. A pesar de los avances en los experimentos in vitro en el que heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones se determinan en sangre entera o de células aisladas, 6,7 esos estudios no se pueden manipular las condiciones de estrés oxidativo durante la enfermedad vascular. En este informe, utilizando marcadas con fluorescencia, anticuerpos específicos contra un ratón de plaquetas y neutrófilos marcador, se describe un protocolo detallado intravital microscópico para monitorear las interacciones heterotípicas de plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado durante TNF-α inducida por inflamación o por láser inducida lesión del músculo cremáster en microvasos de ratones vivos.

Protocolo

1. Preparación de microscopio intravital (Figura 1A)

  1. Preparar tampón superfusión (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, y 17 mM NaHCO 3, pH 7,4).
  2. Girar en un baño de agua circulatorio para mantener la temperatura de tampón y una manta termo controlada a 37 ° C. Airear tampón con gas nitrógeno (5% de CO 2 en equilibrio con nitrógeno).
  3. Encienda el sistema de microscopio (Sutter Lambda DG-4 de alta velocidad longitud de onda cambiador, estación de trabajo, Olympus microscopio BX61W, MPC-200 multi-manipulador, el ROE-200 controlador de fase, cámara de alta velocidad y multiplicador).
  4. Para el modelo de inflamación vascular, utilizar un espejo dicroico 100%. Para inducir la formación de trombos por lesión con láser, sustituir un espejo 100% con un espejo de 50/50% y activar un sistema de ablación láser micropoint.

2. Preparación del músculo cremáster para microscopía intravital (Figura 1B)

  1. Anestesiar a unratón macho (6-8 semanas de edad, C57BL / 6) por inyección ip de ketamina (125 mg / kg de peso corporal (BW)) y xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). La Universidad de Illinois Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión aprobó todo cuidado de los animales y los procedimientos experimentales. Para un modelo de inflamación vascular, inyectar murino TNF-α (0,5 g en 250 l de solución salina) en un ratón intrascrotally 3 h antes de la formación de imágenes (2-2.5 horas antes de la cirugía).
  2. Coloque el ratón sobre una manta térmica controlada a 37 º C en una bandeja de microscopio intravital.
  3. Tire hacia arriba de la piel en la superficie del cuello utilizando fórceps y una incisión en la línea media horizontal de la piel del cuello hasta 1 cm con unas tijeras.
  4. Abra suavemente el músculo cervical utilizando tijeras de punta roma y eliminar el músculo que rodea la tráquea.
  5. Canular un tubo en la tráquea PE90 para eliminar la dificultad para respirar.
  6. Retire suavemente el lado izquierdo del músculo cervical y aislar la vena yugular de los tejidos circundantes.
  7. C annutarde un tubo PE10 en la vena yugular izquierda para la infusión de anticuerpos y anestésicos adicionales.
  8. Tire suavemente hacia fuera y una incisión en la piel del escroto horizontalmente. Para mantener la integridad de los tejidos durante todo el experimento, tampón precalentado se superfused sobre el campo quirúrgico.
  9. Pulse en la parte inferior del abdomen con una pinza y tire con cuidado un testículo con el fórceps otro.
  10. Quite los tejidos conectivos que rodean todo el testículo.
  11. Incisión en el músculo cremáster verticalmente y aplanar el músculo sobre un cubreobjetos de vidrio sobre una bandeja de microscopio intravital fijando la periferia.
  12. Permitir 10-20 min para el músculo para estabilizar antes de la recogida de datos. Arteriolas del músculo cremáster (para la formación de trombos) y vénulas (para la inflamación vascular) con un diámetro de 30-45 micras fueron elegidos para el estudio.
  13. Para mantener las condiciones de anestesia, infusión de 30-50 ml de la misma anestesia aproximadamente cada 30 minutos a través de la cannulus yugular.

3. Microscopía intravital para TNF-α inducida por la inflamación vascular

  1. Después de la colocación del ratón en el microscopio intravital, abierto SlideBook software 5.0 y haga clic en "Ventana de enfoque" en la barra de menú para configurar la óptica adecuadas y objetivas (60X).
  2. Infundir DyLight 488-rata conjugado anti-ratón CD42c (0,1 mg / g de peso corporal en 100 l de solución salina) y Alexa Fluor 647-conjugado anti-ratón de rata Gr-1 anticuerpos (0,05 mg / g de peso corporal en 100 l de solución salina) a través de un cannulus yugular .
  3. Ir a la barra de menús y haga clic en "Captura de imagen" en la barra de herramientas.
  4. Un nuevo menú aparecerá, en "Imagen", seleccione "Factor Bin" como 1x1 y seleccione "640" en la anchura y "460" en la altura.
  5. En "Set Filter", marque la casilla de verificación de los canales que le gustaría exponer y definir el tiempo de exposición para cada uno. Por ejemplo, canal abierto: 10 mseg, FITC canal: 50 mseg, y Cy5 canal: 50 mseg.
  6. Seleccione "Time-Lapse Capture" para ajustar el número de puntos de tiempo e intervalo. For el modelo de inflamación, el número de puntos de tiempo se establece en 1,000-1,500 con un intervalo de 200 ms (el tiempo total transcurrido: 5 min).
  7. Haga clic en "Test" para ver una imagen de un solo avión en el tiempo de exposición especificado para ese canal. Ajuste el tiempo de exposición y / o la luz del microscopio hasta que el histograma muestra una distribución de intensidad suficiente (para captura multi-canal, repita este proceso para cada canal).
  8. Una vez que todos los parámetros se ajustan (canales, tiempos de exposición, etc) en la "Captura de imagen", seleccione "Start" para comenzar la captura.
  9. Monitorear las plaquetas rodantes y adherentes y los neutrófilos durante 5 min en la mitad superior de una vénula cremáster inflamado en el modelo de inflamación vascular. De ocho a diez vénulas diferentes se registran en un ratón.
  10. Las imágenes fueron tomadas con un aumento total de 60x (1,0 NA objetivo de inmersión en agua), dando un tamaño de ventana de 157 m x 118 micras.
  11. Al finalizar el experimento, los ratones fueron sacrificados mediante cervical dislocation.

4. Análisis de datos para el modelo de inflamación vénulas

  1. Abra SlideBook software 5.0 y haga clic en "carpeta" en la barra de menú para abrir un archivo.
  2. Haga clic en el menú de canales desplegable y seleccionar "Abrir con FITC, Cy5, etc"
  3. Haga clic en "renormalizar (barras de color rojo y verde)" y seleccione el canal. Arrastre las barras rojas y verdes a la izquierda oa la derecha para optimizar o menos la señal de fluorescencia.
  4. Haga clic en "Aplicar" y "OK" para actualizar la imagen.
  5. Haga clic en botón "Miniaturas" para seleccionar la visualización actual como predeterminado.
  6. Juega imagen capturada timelapse, y contar neutrófilos rodantes y adherentes durante el período de 5 min.
  7. Para el análisis de la formación del trombo plaquetario, vaya a "Máscara" y seleccione "Crear".
  8. Nombre una máscara y la marca "A imagen actual".
  9. Haga clic en "icono de lápiz grande" en "Marquee Tool" en la vista principal.
  10. Colorea una región fuera del recipiente en la vista principal para establecer una máscara de fondo.
  11. Ir to "máscara", haga clic en "Copiar Esta Plane", haga clic en "máscara Copia en punto de tiempo actual" y seleccione "Todos los puntos de tiempo", y haga clic en "OK".
  12. Para el cálculo de la señal de fondo, vaya a "Estadísticas" y haga clic en "Estadísticas máscara".
  13. Haga clic en "Current Time Lapse 2D o imagen 4D (s)" en el ámbito de imagen y seleccione "Máscara entera" en Ámbito Mask. En Funciones, seleccione "Tiempo transcurrido (hh: mm: ms)" en Fecha de captura, seleccione "Area (píxeles)" bajo Morfometría, seleccione "Nivel máximo" bajo Intensidad, y haga clic en "Exportar" (Este método estadístico nos permite calcular auto-fluorescencia intensidad (señal de fondo)).
  14. Abrir el archivo de texto en MS Office Excel y calcular el valor medio de la señal de fondo durante todo el período de registro. Esta es la intensidad de fluorescencia de fondo.
  15. Para determinar la intensidad de trombos, haga clic en "icono de lápiz grande" de nuevo en el "Marquee Tool" en la vista principal.
  16. Color en el interior del recipiente en la vista principal para ajustar la señal de plaquetas.
  17. Vaya a "Mask", haga clic en "Copiar Esta Plane", haga clic en "máscara Copia en punto de tiempo actual", seleccione "Todos los puntos de tiempo", y haga clic en "OK".
  18. Vaya a "Estadísticas" y haga clic en "Estadísticas máscara".
  19. Haga clic en "Current Time Lapse 2D o imagen 4D (s)" en el ámbito de imagen y seleccione "Máscara entera" en Ámbito Mask. En Funciones, seleccione "Tiempo transcurrido (hh: mm: ms)" en Fecha de captura, seleccione "Area (píxeles)" bajo Morfometría, seleccione "Nivel Sum" en intensidad, y haga clic en "Exportar" (Este método estadístico nos permite calcular la intensidad de fluorescencia en el interior del recipiente).
  20. Abra el archivo de texto en Microsoft Office Excel. La señal de fluorescencia de las plaquetas se calcula restando el valor medio de la intensidad de área de fondo x (píxel) de la suma de la intensidad en el interior de la vasija. Esta es la intensidad de fluorescencia de los trombos de plaquetas.
  21. Repita esto en 30 vénulas diferentes en 3-5 ratones diferentes. A continuación, calcular el valor de la mediana de la intensidad de fluorescencia de las plaquetas.
  22. Aanalizar la rodadura de neutrófilos y la adherencia, la afluencia de rodadura de neutrófilos se determinó durante 5 min en cada vénula y presentados como número de células por minuto. El número de neutrófilos adherentes que eran estacionaria durante> 30 seg y se arrastró lentamente (<10 micras durante 30 s), pero no rodar, se contaron y se presentaron como el número de células por 5 min.

5. Microscopía intravital de trombosis inducida por láser arteriolar

5-1 de calibración de láser de ablación

  1. Colocar un portaobjetos de microscopio reflejado en el escenario, aplicar una pequeña gota de agua destilada a la parte superior de la corredera, y ajustar la intensidad y el enfoque utilizando el ocular.
  2. Abra "Ventana Focus" y seleccione la opción "FRAP" en la pestaña SlideBook software 5.0.
  3. Ajuste la potencia del láser en 40-50, y ajustar "repeticiones doble clic" y del "tamaño doble clic" a 8. Marque en la "guía" casilla para mostrar un conjunto de punto de mira.
  4. Seleccione la opción "Arrow" icono de la barra de tareas on la parte superior de la pantalla.
  5. En la sección "Alineación FRAP" haga click en "Fire siguiente". Un pequeño punto debería aparecer cerca de la esquina inferior izquierda de la pantalla. Una vez que la mancha aparece, haga doble clic en el centro de la misma. Una vez que se hace clic, otro punto debería aparecer por encima ya la derecha del punto primero, haga doble clic en él. Repita esto para 16 puntos (puntos 16 º aparecerá en la esquina inferior derecha.) Haga clic en "Guardar" cuando haya terminado de actualizar los parámetros de calibración.
  6. Para probar la exactitud de la calibración, haga clic en el "Centro" botón, un pequeño punto debe aparecer en el centro de la pantalla. Si no es así, repita la calibración hasta que la precisión deseada.

5-2 inducida por láser formación de trombos arteriolar

  1. Coloque un ratón anestesiado (véase el procedimiento de 2-2 a 2-12) en la platina del microscopio.
  2. En virtud de la "captura" de la ventana, seleccione un protocolo o crear uno nuevo. Los ajustes son los siguientes: CY5 (70 ms de exposición), Open (10 mseexposición c), y FITC (50 exposición mseg). La imagen se capturó más de 20 minutos (aproximadamente 2.400 puntos de tiempo con un intervalo de tiempo de 500 ms).
  3. Infundir DyLight 488-anti-ratón conjugado CD42c y Alexa Fluor 647-anti-ratón conjugados Gr-1 anticuerpos como se describe anteriormente.
  4. Optimizar los parámetros de microscopio incluyendo la intensidad de fluorescencia y la imagen de campo brillante como se describe en 3-3 a 3-7.
  5. Haga clic en el botón "Test" para asegurar la intensidad adecuada campo claro o señal de anticuerpos, la colocación de las arteriolas y enfoque.
  6. Haga clic en "Inicio" para iniciar el proceso de captura de imágenes.
  7. Antes de disparar el láser de ablación, asegúrese de que el icono del puntero del ratón ha sido seleccionado y que la pared del vaso está enfocada.
  8. Para disparar el láser, haga doble clic en un punto de 2-3 micras interna de la pared del vaso. Lesión de las células endoteliales de las arteriolas provoca un cambio de forma visual que deben ser evidentes en la imagen de campo claro, seguido por la acumulación de plaquetas. Monitor de tromboformación de 5 min después de la lesión con láser.
  9. Cinco minutos después de la lesión con láser (el tamaño del trombo ahora debe ser estable) pausa y cancelar la captura. Posteriormente, iniciar una captura con 2400 puntos de tiempo con un intervalo de 500 ms para registrar las plaquetas adherentes y neutrófilos rodantes / adherentes durante 20 min. De tres a cinco arteriolas son registrados en un ratón.
  10. Al finalizar el experimento, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical.

6. Análisis de datos para el modelo de trombosis arteriolar

  1. Repase los pasos 4.1 a 4.5.
  2. Para obtener la intensidad de la fluorescencia de fondo durante la formación de trombos de plaquetas, pasar a través de los pasos 4,7 4,14.
  3. Vaya a "Mask", haga clic en "segmentos", seleccione FITC en el canal, e insertar el valor medio de la señal de fondo en Low. Haga clic en "Aplicar" y "OK".
  4. Para analizar la intensidad de fluorescencia de trombos de plaquetas (DyLight 488-conjugado anti-CD42c anticuerpo), repasar los pasos 4,18 por 4,19. Para el cálculo de la señal de anticuerpos, "Intensidad Sum" se resta de la señal de fondo ("Intensidad máxima" x "en la zona (píxeles)"). Esta es la intensidad de fluorescencia de los trombos de plaquetas.
  5. Para cuantificar los neutrófilos rodantes y adherentes, jugar el timelapse y contar el número de células que visiblemente rodar sobre el trombo plaquetario más de 20 min. Rodadura se define como una disminución en la velocidad de neutrófilos, mientras que la interacción con el trombo de plaquetas durante al menos 2 segundos. Neutrófilos adherentes se definen como cualquier neutrófilos que permanecen unidos a los trombos de plaquetas durante al menos 2 min. El número de neutrófilos rodantes y adherentes se presentó como el número de células por 20 min. La velocidad de rotación se calculó utilizando un sistema de rastreo de partículas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Usando un análisis detallado microscopía intravital, heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado se visualizaron mediante la infusión de anticuerpos marcadas con fluorescencia contra una de plaquetas (CD42c) o neutrófilos marcador (Gr-1) en ratones vivos.

En un modelo de TNF-α inducida por inflamación venular, neutrófilos más de rodadura se adhirieron de forma estable al endotelio presumiblemente por la interacción de las integrinas β2 activados con ICAM-1 dura...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Aquí se describe un protocolo detallado para tiempo real microscopía de fluorescencia intravital para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y trombosis. Anteriormente, los enfoques similares microscópicas de fluorescencia se registraron para estudiar el mecanismo molecular de la formación de trombo y la inflamación vascular. 8,12 Desde el heterotípicos interacción célula-célula podría ser importante para la oclusión vascular en el...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún interés en competencia financiera.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (P30 HL101302 y RO1 HL109439 a JC) y la American Heart Association (SDG 5270005 a JC). A. Barazia fue apoyado por una beca de formación T32HL007829 NIH.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NaClFisher Scientific7647-14-5
KClSigma-Aldrich7447-40-7
CaCl2 2H2OSigma-Aldrich10035-04-8
MgCl2 6H2OFisher Scientific7791-18-6
NaHCO3Fisher Scientific144-55-8
0.9% NaCl solución salinaHospira0409-4888-10
KetaminaHospira0409-2051-05
XilacinaLloyd
Tubo intramédico (PE 90)BD Diagnostics427421
Tubo intramédico (PE 10)BD Diagnostics427401
Murine TNF-αR& D Systems410-MT
Dylight 488- anticuerpo CD42b anti-ratón para ratas etiquetado Emfret AnalyticsX488
Alexa Fluor 647-conjugado anti-ratón Anticuerpo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)BioLegend108418
NESLAB EX baño de agua/circuladorMicroscopio Thermo-Scientific
Olympus BX61WOlympus
TH4-100 PotenciaOlympus
Lambda DG-4Sutter
MPC-200 multi-manipuladorSutter
R–-200 controlador de etapaSutter
C9300 cámara de alta velocidadHamamatsu
Intensificadorde video Láser de
Instrumentos Fotónicos, Inc.
SlideBook 5.0Innovaciones en
ablación internacional imágenes inteligentes

Referencias

  1. Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
  2. Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
  3. Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
  4. Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
  5. Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
  6. Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
  7. Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
  8. Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
  9. Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
  10. Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
  11. Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
  12. Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
  13. Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
  14. Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
  15. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  16. Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Microscop a intravitalanticuerpos fluorescentesm sculo cremasterTNF alfalesi n por l ser
Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.