Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

Resumen

Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.

Resumen

Un punzón de biopsia de la piel se utiliza comúnmente para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos (IENFD) para el diagnóstico de ^1,2 polineuropatía periférica. En la actualidad, es una práctica común para recoger biopsias de piel 3 mm a partir de la pata distal (DL) y el muslo proximal (PT) para la evaluación de las polineuropatías dependiente de la longitud ^3. Sin embargo, debido a la naturaleza multidireccional de IENFs, es un reto para examinar superposición de estructuras nerviosas a través del análisis de formación de imágenes de dos dimensiones (2D). Alternativamente, imágenes en tres dimensiones (3D) podría proporcionar una mejor solución para este dilema.

En el presente informe, se presentan métodos para la aplicación de imágenes en 3D para estudiar la neuropatía dolorosa (PN). Con el fin de identificar IENFs, muestras de piel se procesan para el análisis de inmunofluorescencia de producto de gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal sartén. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD disuadirminada por inmunohistoquímica utilizando PGP microscopía de campo claro ^4. En el estudio actual, se aplicó análisis de doble inmunofluorescencia para identificar IENFD total de, utilizando PGP, y IENF nociceptivo, a través del uso de anticuerpos que reconocen la tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A), el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento de los nervios ^5. Las ventajas de IENF co-tinción con PGP y Trk A anticuerpos beneficia el estudio de la PN por tinción con claridad, fibras nociceptivas PGP-positivos. Estas señales fluorescentes se pueden cuantificar para determinar los cambios morfológicos y IENFD nociceptivas de IENF asociados con PN. Las imágenes fluorescentes se adquirieron por microscopía confocal y se procesaron para análisis en 3D. 3D-imagen proporciona capacidades de rotación seguir analizando los cambios morfológicos asociados a la PN. En conjunto, co-tinción fluorescente, la imagen confocal y análisis 3D se benefician claramente el estudio de la PN.

Introducción

En la actualidad, es una práctica común para los médicos para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos, (IENFD) a partir de biopsias de piel en sacabocados, que pueden ser utilizados para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas ^{3, 6-8.} Las biopsias se toman de la pierna distal (DL), 10 cm por encima del maléolo lateral y el muslo proximal (PT), 20 cm por debajo de la espina ilíaca anterior ^9. Todos IENF están etiquetados de usar el producto gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal bandeja ^10-12. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENF....

Protocolo

Parte A: La inmunohistoquímica

Preparación de la placa de 96 pocillos y la prevención de la tinción de fondo biopsias en sacabocados de piel se recogen a partir de sujetos humanos y se incubaron durante 12-24 h en solución fijadora (2% de paraformaldehído con una solución de L-Lisina 0,75 M (pH 7,4) y 0,05 mM de peryodato de sodio) a 4 ° C como se ha descrito previamente ^8. Las muestras son entonces cryoprotected en tampón fosfato salino (PBS) con 20% de glicerol a 4 º C durante hasta 1 semana, incrustado en un medio de montaje de temperatura óptima de corte (OCT), a continuación, se seccionó en 50 micras de espesor secciones en u....

Resultados

Se aplicó el protocolo actual para estudiar la morfología de IENF en PT y DL biopsias de piel de pacientes con PN. La piel, a partir de tres sujetos, se recogió en la Universidad de Utah para demostrar la patomorfología asociado con PN. Los temas incluyen: Caso 1: varón de 51 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 14 meses, la puntuación de dolor: 51), y Caso 2: varón de 56 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 108 meses, la puntuación de dolor: 47), y Caso .......

Discusión

Medición de IENFD ha sido ampliamente utilizado para determinar el grado de neuropatías periféricas ^13,14. En la actualidad, el protocolo más comúnmente utilizado sólo mide las densidades de las fibras nerviosas que penetran en la membrana basal de la epidermis; no toma en consideración de ramificación axonal y / o cambios morfológicos de los nervios. Además, no se ha demostrado el análisis IENFD actual para correlacionar IENFD con la presencia de dolor en PN ^15.

Hemos .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	Para componer 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Conejo policlonal)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomiosina relacionada-Quinasa A (cabra policlonal)	R& D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 burro α-conejo	Invitrogen	A21206	AF488 burro α-cabra
Alexa Fluor 647 burro α-cabra	Invitrogen	A21447	AF647 burro α-cabra
Albúmina, de suero bovino	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
Bucle no calibrado	LeLoop	MP 199025
placa de ensayo de infusión Loop de 96 pocillos	Corning Incorporated	3603	pocillos
Reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Microscopio Cubierta de vidrio 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Cubreobjetos
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15	Portaobjetos de microscopio
Olympus Fluoview Microscopio confocal de barrido láser	Olympus	FV500	Microscopio confocal
Temperatura óptima de corte	Sakura	4583	OCT
Criostato Leica		Leica CM1850	Criostato

Placa de