El líquido ventricular cefalorraquídeo (LCR) baña las células de la corteza cerebral y neuroepitelial progenitoras durante el desarrollo temprano del cerebro del embrión. Aquí se describe el método desarrollado para aislar CSF ventricular de embriones de roedores de diferentes edades con el fin de investigar su función biológica. Además, demostramos nuestra disección cerebral cortical explantes y técnica de cultivo que permita el crecimiento de explantes con volúmenes mínimos de medio de cultivo o LCR.
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Artículo de método
Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral
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Resumen
Resumen
El CSF es un fluido complejo con un proteoma que varía dinámicamente durante todo el desarrollo y en la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la CSF naciente diferencia del líquido amniótico tras el cierre del tubo neural anterior. El volumen de LCR aumenta entonces en los días subsecuentes como las células progenitoras neuroepiteliales que recubren los ventrículos y el plexo coroideo generan LCR. Los embriones de contactos de LCR la apical ventricular superficie de las células madre neurales del cerebro en desarrollo y la médula espinal. CSF proporciona presión de fluido crucial para la expansión del cerebro en desarrollo y distribuye crecimiento importante promoción de los factores de las células progenitoras neurales de una manera temporal específica. Para investigar la función de los CSF, es importante aislar muestras puras de embrionario CSF sin contaminación de la sangre o del tejido en desarrollo telencephalic. Aquí se describe una técnica para aislar muestras relativamente puras de CSF del ventrículo embrionario que se pueden utilizar parauna amplia gama de ensayos experimentales, incluyendo la espectrometría de masas, electroforesis de proteínas, y cultivo de células y explante primario. Se demuestra cómo diseccionar y cultura explantes corticales en membranas porosas de policarbonato con el fin de crecer tejido en desarrollo cortical con volúmenes reducidos de los medios de comunicación o CSF. Con este método, los experimentos se pueden realizar utilizando CSF de diferentes edades o condiciones para investigar la actividad biológica de la proteoma CSF en las células diana.
Introducción
El líquido cefalorraquídeo es un líquido complejo que baña el neuroepitelio desarrollo 1-6 y ofrece 7 Presión esencial y la promoción del crecimiento claves para el desarrollo del cerebro 8-12. Para estudiar el CSF en el curso del desarrollo del cerebro, hemos desarrollado técnicas para aislar CSF del ventrículo desde el desarrollo de embriones de rata o ratón durante varias etapas de desarrollo 6,9. Los métodos anteriores de aislamiento incluyó el uso de un cristal de micro-aguja y aislar el CSF utilizando un micro-inyector de 1,2. Nuestro método utiliza un vaso capilar micro-pipeta cuya punta se ha tirado para ....
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Protocolo
1. Aislamiento de embriones / Preparación
Esta técnica se puede utilizar para el ratón o la rata. En este protocolo se demuestra la técnica de recolección de LCR y disección cerebral cortical explantes con cerebro de ratón embrionario. Vamos a comentar sobre las diferencias importantes en comparación con las ratas ratones que existen dentro de las técnicas generales. Para el sistema de estadificación edad embrionaria, E1 es clasificado como el día de la clavija de ratas, y E0.5 se clasifica como el día de la clavija de ratones.
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Resultados
La recolección de LCR debe producir un líquido claro y transparente. No debería haber ninguna evidencia de contaminación de la sangre, como se demuestra por un fluido teñido de color rojo o amarillo en el aspirado y en el tubo Eppendorf. También debe haber evidencia de tejidos en el aspirado y el tubo Eppendorf. Cuando el CSF se centrifuga, se puede también evaluar el CSF microscópicamente para garantizar que no hay contaminación. Si hay signos de contaminación, el LCR debe ser desechada. De una camada ratón E14.5, se p.......
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Discusión
El método descrito para la recolección de líquido cefalorraquídeo ventricular ha dado muestras relativamente puras de CSF embrionario con la composición de proteína estable y la actividad consistente en una serie de ensayos celulares 9. Con una técnica buena colección y tamaño de la camada de diez ratones E14.5, se puede esperar para cobrar 10-15 l de LCR y de una camada de ratas E16, se puede esperar para recoger alrededor de 50-90 l de LCR. Esta técnica minimiza la contaminación de recogida de la sangre y e.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos por el apoyo del NIH (R00 NS072192 números Premio a MKL, HD029178 a AS.L., y 2 RO1 NS032457 a CAW). MKL ha recibido del Hospital Infantil de Boston Career Fellowship Desarrollo de la Confraternidad / Harvard Medical School Shore y un compañero de la Alfred P. Sloan Foundation. CAW es un investigador del Howard Hughes Medical Institute.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / material | Empresa | Número de Catálogo | Comentarios |
| Wiretrop II agujas capilares | Drummond Scientific | # 5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | # 184 SIL ELAST kit | |
| Aspirador conjunto del tubo | Sigma | # A5177-5EA | |
| Filtro desechable | Venturi o farmacia local | no disponible | Filtro de cigarrillo estándar |
| Roundstock cuchillo oftálmico (15 cuchillo puñalada grado) | World Precision Instruments, Inc. | # 500250 | |
| 35mm plato de cristal cultura fondo | MatTek Corp. | # P35G-1.5-14-C | |
| Platino-iridio de alambre | Tritech Investigación | # PT-9010-010-3 pies | |
| Nuclepore Track Etch-membrana | Whatman | # 09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | # SH30031.FS | |
| Tijeras iridectomía | Herramientas Artes Ciencias | # 15000-02 |
Referencias
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A.
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Aislamiento del l quido cefaloraqu deoRecolecci n de LCR embrionarioCultivo de explante corticalAspiraci n de LCR ventricularCultivo en membrana de policarbonatoVerificaci n de contaminaci n del LCRPreparaci n de micropipetasT cnica de disecci n de embrionesProtocolo de centrifugaci n de LCRSeparaci n del hemisferio cortical
