En este artículo se presenta un método para analizar los microvasos tumorales in vivo utilizando dinámica de fluorescencia videomicroscopy contraste. Dos parámetros cuantitativos se adquirieron: la densidad capilar funcional que refleja la vascularidad del tumor, y las fugas de índice que refleja la falta de estanqueidad de la pared endotelial.
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Artículo de método
Imágenes in vivo de la angiogénesis tumoral usando fluorescencia confocal videomicroscopia
En este artículo
Resumen
Resumen
Con fibras de fluorescencia confocal de formación de imágenes in vivo con un haz de fibra óptica utiliza el mismo principio que la microscopía confocal fluorescente. Se puede excitar fluorescencia en elementos in situ a través de las fibras ópticas, y luego grabar algunos de los fotones emitidos, a través de las mismas fibras ópticas. La fuente de luz es un láser que envía la luz de excitación a través de un elemento dentro del haz de fibras y ya que revisa sobre la muestra, recrea una imagen píxel a píxel. Como este análisis es muy rápido, al combinarlo con el software de procesamiento de imágenes dedicado, imágenes en tiempo real con una frecuencia de 12 fotogramas / seg se pueden obtener.
Hemos desarrollado una técnica para caracterizar cuantitativamente la morfología y la función capilar, usando un dispositivo de videomicroscopía de fluorescencia confocal. El primer paso en nuestro experimento era grabar películas 5 segundos en los cuatro cuadrantes del tumor para visualizar la red capilar. Todas las películas fueron procesados mediante el software (ImageCell, Mauna Kea Tecnología, París Francia) que realiza una segmentación automatizado de los vasos alrededor de un diámetro elegido (10 micras en nuestro caso). Por lo tanto, se podría cuantificar la "densidad capilar funcional", que es la relación entre el área total del vaso y el área total de la imagen. Este parámetro fue un marcador sustituto para la densidad microvascular, por lo general medido usando herramientas de patología.
El segundo paso fue grabar películas del tumor durante 20 min para cuantificar la fuga del agente de contraste macromolecular a través de la pared capilar al intersticio. Mediante la medición de la relación de intensidad de la señal en el intersticio más que en los vasos, se obtuvo un "índice de fugas ', que actúa como un marcador sustituto para la permeabilidad capilar.
Introducción
La angiogénesis es un proceso complejo 1 que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes. Los cambios patológicos en la microcirculación del tejido, compuesto de las arteriolas, capilares y vénulas, están implicados en una amplia gama de enfermedades tales como el cáncer, la inflamación, o la diabetes. Por tanto, es esencial para desarrollar métodos para evaluar cuantitativamente la estructura y función de los microvasos. Imaging permite el estudio de los microvasos en un no-o de forma micro-invasivo, en tiempo real e in vivo, y medidas repetidas en el tiempo en el mismo animal 2.
Actualmente, con contraste dinámico (DCE) de formación de imágenes 3 es comúnmente utilizado para evaluar la microcirculación del tejido. De formación de imágenes de contraste mejorado dinámica es una técnica que sigue a lo largo del tiempo la biodistribución de un trazador inyectado por vía intravenosa. A partir de esta adquisición, parámetros cuantitativos se pueden extraer lo que refleja la vascularización del tejido. Imágenes DCEse ha utilizado con mayor frecuencia con la TC, resonancia magnética o ecografía. Sin embargo, estas técnicas de imagen no permiten la visión directa de los microvasos, ya que su resolución, que no sea con el uso de dispositivos experimentales específicos, más a menudo permanece macroscópica.
En este trabajo, nos proponemos estudiar la vascularización del tumor a escala microscópica como in vivo utilizando imágenes ópticas con contraste dinámico, con Fibered videomicroscopy confocal. Se utilizó un agente de contraste macromolecular (FITC-dextrano) que permanece exclusivamente dentro de los vasos o las fugas a través de la barrera endotelial en el intersticio, de acuerdo con su peso molecular y las características del endotelio del tejido estudiaron 4. Esto permitió que el estudio de la estructura tanto de los microvasos, delineando correctamente los vasos, y la permeabilidad capilar, filtrando y acumulando en el intersticio.
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Protocolo
1. Preparación del agente de contraste
- Para FITC-dextrano de 70 kDa, la dosis inyectada es de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextrano diluyó en 0,1 ml de solución salina para un ratón de peso 20 g).
- El agente no debe exponerse demasiado tiempo a la luz. Para evitar la decoloración, se recomienda para cubrir el tubo con papel de aluminio.
2. Anestesia
- Los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de 01:04 de xilazina (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Francia) y ketamina (ketamina 500, Virbac, Carros, Francia), respectivamente 66 mg / kg y 264 mg / kg para un ratón de 20 g.
3. Preparación del Organo de Interés
- Se afeitaron los ratones en el lugar de interés (por ejemplo, más de un tumor subcutáneo). El pelo de los animales es a menudo auto-fluorescente cuando blanco. Al negro, que absorbe la luz.
- La piel hacia el órgano a ser fotografiado se realizó una incisión. Es importante esperar hasta que el malditog se ha detenido antes de inyectar el agente de contraste, de lo contrario, se escapará en la sangre y contaminar la imagen.
4. Adquisición
- El agente de contraste se inyecta a través de ya sea de la vena yugular o la vena caudal. Hay poca o ninguna señal de fondo es en el órgano observada en ausencia de un agente de contraste fluorescente.
- La sonda se colocó en frente del órgano a explorar. En nuestro estudio, este fue el tumor.
- El láser se enciende para iluminar el tumor y ver la fluorescencia en los capilares.
- El tumor se exploró manualmente moviendo la sonda en un movimiento muy lento durante la grabación para visualizar la red capilar. Es importante mantener una mano firme, y esta técnica requiere un poco de experiencia. En nuestro estudio, este primer paso permitió la cuantificación de la densidad capilar funcional.
- El segundo paso fue la adquisición dinámico en el tiempo. Para este estudio, se utilizó un 70 kDa FITC-dextrano. No hay fugas intersticial en la mayoría de los órganos normales pero no es en tumores. Para adquirir imágenes de la misma ubicación en el tiempo (como en nuestro caso), es importante establecer un sistema para mantener la sonda en el área de interés. Esto se hizo mediante el uso de un soporte hecho a mano para sujetar la sonda, y mediante la colocación de un poco de gel de ultrasonido en la punta de la sonda. Antes de la grabación, el tiempo se pasó a estabilizar la sonda colocada en contacto con el tumor. Una vez que la posición estaba asegurada, sólo había movimiento mínimo debido a la respiración del ratón. El láser se enciende para grabar 3 imágenes cada 30 seg durante 20 min para detectar la presencia de la fuga capilar. Se apaga entre cada grabación para reducir el blanqueo de contraste.
- En nuestro experimento, los ratones fueron sacrificados al final del procedimiento para el análisis histológico de los tumores.
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Resultados
Con los datos recogidos, podríamos analizar cuantitativamente diferentes parámetros que reflejan la microcirculación.
Se estudió in vivo la red vascular periférica de un tumor de colon implantadas en ratones Balb-c usando un sistema de videomicroscopía de fluorescencia confocal fibrado (Cellvizio, Maunakea Tecnología, París, Francia 2), después de la inyección de un agente de contraste fluorescente macromolecular isotiocianato de fluoresceína-dextrano ( FITC-dextrano) con...
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Discusión
El estudio de la microcirculación tumoral se ha convertido en esencial en la comprensión de la fisiopatología del crecimiento del tumor, diseminación y respuesta al tratamiento 1. De formación de imágenes óptico es una de las técnicas que se pueden utilizar para observar los capilares usando un agente de contraste fluorescente y para cuantificar morfológica (densidad capilar funcional) y los parámetros (índice de fuga) funcionales.
La imágenes de microscopía de fluorescencia se ut...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Insulina serynge Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Isotiocianato de fluoresceína-dextrano 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluido en solución salina |
| Videomicroscopía confocal con fibra | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Kit de calibración y limpieza para LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Tienda a 4 ° C |
| ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| software de mosaico | MaunaKea Technologies | ||
| software de detección de recipientes | MaunaKea Technologies |
Referencias
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
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- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
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Reimpresiones y permisos
