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Artículo de método

PRP como un nuevo enfoque para prevenir la infección: Preparación y

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DOI:

10.3791/50351

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9 de abril de 2013

 , 
1Department of Orthopaedics, School of Medicine, West Virginia University , 2Department of Orthopaedics, Stem Cell Research Center, University of Pittsburgh, 3WVNano Initiative, 4Mary Babb Randolph Cancer Center

En este artículo

Resumen

Implante asociada a la infección es una complicación clínica significativa. Este estudio describe un enfoque utilizando plasma rico en plaquetas (PRP) para prevenir infecciones relacionados con el implante, presenta el protocolo para la preparación de PRP con concentración de plaquetas constante, e informa de las propiedades antimicrobianas de los recientemente identificados PRP y protocolos relacionados para examinar tales propiedades antimicrobianas In vitro.

Resumen

Implante infección asociada se está volviendo más y más difícil para la industria de la salud en todo el mundo debido a la creciente resistencia a los antibióticos, la transmisión de bacterias resistentes a antibióticos entre animales y seres humanos, y el alto costo de tratamiento de las infecciones.

En este estudio, se describen una nueva estrategia que puede ser eficaz en la prevención de las infecciones relacionadas con implante basado en las propiedades antimicrobianas potenciales de plasma rico en plaquetas (PRP). Debido a sus propiedades bien estudiados para promover la curación, PRP (un producto biológico) ha sido cada vez más utilizado para aplicaciones clínicas, incluyendo cirugías ortopédicas, cirugía periodontal y oral, cirugías maxilofaciales, cirugías plásticas, medicina deportiva, etc

PRP podría ser una alternativa avanzada a los tratamientos convencionales con antibióticos para prevenir las infecciones asociadas a implantes. El uso de PRP puede ser ventajoso en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos SINCE PRP es menos probable que induzca resistencia a los antibióticos y PRP antimicrobiana y propiedades curativas que promueven puede tener un efecto sinérgico en la prevención de infecciones. Es bien conocido que los agentes patógenos y las células humanas están compitiendo por superficies de los implantes, y PRP propiedades de curación promoción podría mejorar la unión celular humana reduciendo así las probabilidades de infección. Además, el PRP es inherentemente biocompatible, seguro y libre de riesgo de las enfermedades transmisibles.

Para nuestro estudio, hemos seleccionado varias cepas clínicas de bacterias que se encuentran comúnmente en las infecciones ortopédicas y examinó si PRP tiene propiedades in vitro antimicrobianos contra estas bacterias. Hemos preparado PRP utilizando un enfoque de centrifugación dos veces, que permite la concentración de plaquetas mismo que debe obtenerse para todas las muestras. Hemos logrado resultados consistentes antimicrobianos y se ha encontrado que el PRP tiene fuerte propiedades in vitro antimicrobianos contra bacterias como methicillin sensible a la meticilina y resistentes a Staphylococcus aureus, Streptococcus del Grupo A, y Neisseria gonorrhoeae. Por lo tanto, la utilización de PRP puede tener el potencial para prevenir la infección y reducir la necesidad de un costoso tratamiento post-operatorio de infecciones relacionados con el implante.

Introducción

Implante asociada a la infección es una complicación clínica significativa. Staphylococcus aureus (S. aureus) es uno de los microorganismos más comunes aislados de infecciones relacionados con el implante. Es capaz de producir una biopelícula que recubre las superficies de implantes y puede conducir a 1,2 infección resistente a antibióticos. El tratamiento de las infecciones asociadas a implantes con frecuencia requiere hospitalización a largo plazo para desbridamientos repetidos y prolongados de terapia antibiótica parenteral. En los casos resistentes a antibióticos, la extracción del implante puede ser necesario. La creciente resistencia de las bacterias a los antibióticos también se ha referido a los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) como "uno de los problemas de salud del mundo más urgentes." Con el tiempo, sin el desarrollo de tratamientos antimicrobianos nuevos y eficaces, es posible que los fármacos múltiples patógenos resistentes será intratable con los antibióticos convencionales. Prevención de implante asociadoinfección es por lo tanto importante y nuevos agentes profilácticos o enfoques son necesarios para la prevención de tales infecciones.

Plasma rico en plaquetas (PRP) es una concentración de sangre autóloga que contiene más de 30 factores de crecimiento que pueden ayudar con la curación del hueso y de injerto de hueso 3-5. La aplicación de PRP para la reconstrucción ósea y maduración del tejido blando se ha informa cada vez más en las clínicas debido a su alta concentración de diversos factores de crecimiento liberados por las plaquetas.

Varias características de PRP PRP indican que también pueden tener propiedades antimicrobianas 6-9. PRP contiene un gran número de plaquetas, una alta concentración de leucocitos (que puede poseer defensa del huésped-acciones contra bacterias y hongos), y varios péptidos antimicrobianos 7,8,10. En un estudio reciente de una gran cohorte de pacientes quirúrgicos cardíacos, se reveló que el uso intraoperatorio de PRP-gel durante el cierre de la herida significativamente disminuyó la incidencia de infección esternón superficial y profunda 11. Por estas razones y observaciones, la hipótesis de que el PRP, además de sus bien estudiadas promueven la curación de las propiedades, tiene propiedades antimicrobianas. Las ventajas potenciales de la utilización de PRP para prevenir la infección pueden incluir: (i) PRP es menos probable que induzca resistencia en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos. (Ii) PRP también tiene propiedades que favorecen la cicatrización que puede tener un efecto sinérgico en la prevención de infecciones; curación promotoras de PRP de propiedades podrían proporcionar un sello para evitar la adhesión bacteriana reduciendo así las probabilidades de infección por los patógenos y las células humanas están compitiendo para superficies de implante 12 , 13. (Iii) PRP es inherentemente biocompatible, seguro y libre de riesgo de las enfermedades transmisibles.

Nuestro objetivo a largo plazo es el uso de PRP como un nuevo enfoque para prevenir implante asociada infections. El objetivo de este estudio fue la preparación de PRP utilizando un enfoque de centrifugación dos veces, para examinar PRP en propiedades antimicrobianas in vitro, y para describir los protocolos para evaluar tales propiedades antimicrobianas.

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Protocolo

1. Preparación y activación de PRP

1.1 Extracción de sangre

  1. Anestesiar conejo por inhalación de isoflurano (2% en O 2 para la inducción y 1% para el mantenimiento).
  2. Dibujar 2 ml 0,129 M citrato trisódico (una solución anticoagulante) en una jeringa de 20 ml. La solución de citrato tri-sódico se prepara disolviendo 1,897 g de tri-citrato de sodio en 50 ml de H 2 O destilada y filtrar con un filtro de 0,22 micras estéril.
  3. Esterilizar la oreja del conejo utilizando 70% de etanol.
  4. Extraer la sangre (por ejemplo, 5 ml) de la vena de la oreja de conejo a través de una aguja de mariposa (25 G) conectado a la jeringa.
  5. Mezclar la sangre con la solución de citrato de tri-sodio por agitación suave. La relación de volumen de sangre y tri-sodio solución de citrato es de 9:1.

1,2 PRP preparación (Figura 1)

  1. Transferir la sangre anticoagulada a un tubo de 50 ml de centrífuga de plástico. Tomar una alícuota de 10 lde sangre para determinar el recuento de plaquetas basal utilizando hemocitometría.
  2. Se centrifuga la sangre a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT) en una centrífuga con un rotor basculante. Establecer la aceleración y la velocidad de frenado a baja (Figura 1).
  3. Después de la centrifugación, la sangre se separa en tres capas. La capa inferior es principalmente células de la sangre rojas, la capa media (comúnmente conocido como la "capa leucocitaria") se compone de concentrados de plaquetas y leucocitos, y la capa superior es principalmente plasma, que es el componente líquido de la sangre, y las plaquetas ( Figura 1). Transportar con cuidado el tubo de centrífuga a una campana de cultivo de células; no molestar las capas. Transferir todo el plasma, capa leucocitaria, y 2-3 mm de espesor capa de glóbulos rojos en un tubo de plástico de 15 ml usando una pipeta de 1 ml de plástico.
  4. Centrifugar la muestra transferida por segunda vez a 3.000 xg durante 15 min a TA. La capa superior (sobrenadante) se considera plasma pobre en plaquetas (PPP) und es transferido a un nuevo tubo.
  5. Obtener PRP mediante el ajuste de la concentración de plaquetas en la muestra de sangre restante utilizando PPP para obtener 2,0 x 10 6 plaquetas / l (determinado por hemocitometría).

1,3 PRP activación

  1. Preparar la solución de PRP activación mediante la disolución de 5.000 IU trombina bovina con 5 ml de cloruro de calcio 10% a la concentración de trabajo de 1.000 UI / ml.
  2. Añadir la solución de activación de PRP y PPP, y mezcle la solución pipetear repetidamente para formar PRP y PPP-geles. La relación en volumen de la solución de activación de PRP o PPP es de 1:4.

2. Prueba in vitro a los antimicrobianos de PRP usando el ensayo de Kill curva (Figura 2)

  1. El uso de un asa de inoculación estéril, añadir varias colonias de S. aureus a partir de su cultivo en placa durante la noche en 5 ml de caldo Mueller Hinton (MHB) en un tubo de plástico. Vórtice brevemente y luego incubar la muestra durante 2 horas a 37 ° C. Próximo, La densidad óptica de los medios de comunicación bacteriana se determinó utilizando un espectrofotómetro y se ajustó a una densidad óptica igual a ~ 1 x 10 8 UFC / ml en base a la curva estándar predeterminado.
  2. Hacer una dilución de 100 veces utilizando PBS para obtener 1 x 10 6 UFC / ml y colocar el inóculo en hielo.
  3. Configurar y etiquetar estériles, desechables 5 ml de fondo redondo tubos de poliestireno, y preparar los siguientes grupos de la muestra como se indica en la Tabla 1 para un volumen final de 2 ml en cada tubo.
  4. Añadir PRP, PPP, o PBS primero a los tubos de poliestireno, seguido por la solución de trombina para la activación (formación de gel). A continuación, agregue MHB y luego la S. inóculos aureus (1 x 10 6 UFC / ml) para obtener la concentración final de 1 x 10 5 UFC / ml.
  5. Incubar los tubos a 37 ° C con agitación orbital a 150 rpm.
  6. En los puntos de tiempo predeterminados (por ejemplo, 0, 1, y h 2), mezclar las soluciones en cada tubo mediante pipeteo repetido (estepaso es importante ya que las bacterias pueden ser atrapados dentro del gel de PRP). Tomar 10 l de muestra, diluir en serie con una solución salina estéril al 0,9%, y pipetear una parte alícuota de 100 l de cada dilución en placas en un agar de tripticasa de soja (TSA, con sangre de oveja al 5%) para el recuento de CFU placa.
  7. Cultura las placas de agar durante la noche a 37 º C, y luego contar y registrar las colonias de las placas. Representan los datos en una escala logarithimic con el tiempo (hr) en el eje X y UFC / ml en el eje y.

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Resultados

PRP se preparó reproducible utilizando un enfoque de centrifugación dos veces (Figura 1). PRP se encuentra a presentar fuerte (hasta 100-veces la reducción de UFC) en las propiedades antimicrobianas in vitro contra S. aureus resistente aureus (MRSA) (Figura 3), que se encuentra comúnmente en los hospitales de todo el mundo 14. Del mismo modo, el PRP tiene fuertes propiedades antimicrobianas en contra de estafilococos sensibles S. aureus...

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Discusión

Plasma rico en plaquetas se ha usado cada vez más para aplicaciones clínicas debido a sus propiedades de promoción de la cicatrización 15-17. En el presente estudio, el PRP se presenta como un nuevo enfoque para la prevención de infecciones. PRP se encontró que tienen fuertes propiedades antimicrobianas contra MRSA, MSSA, estreptococo del grupo A, y Neisseria gonorrhoeae. Las principales ventajas de PRP, en comparación con los tratamientos convencionales con antibióticos para la prevención d...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Therwa Hamza, John E. Tidwell, Clovis Nina, y Suzanne Smith para la asistencia experimental y Suzanne Smith para corrección de pruebas. Los autores también agradecen a John Thomas, PhD para la prestación de los aislados bacterianos clínicos y John B. Barnett, PhD, por su apoyo y el uso del laboratorio de seguridad biológica en el Departamento de Microbiología, Inmunología y Biología Celular en la Universidad de Virginia Occidental. Los autores agradecen el apoyo financiero de la Osteosíntesis y Trauma Care Foundation y la National Science Foundation (# 1003907). Microscopio experimentos y análisis de imagen se realizaron también en el West Virginia University Fondo Imaging, que es apoyado en parte por el Mary Babb Randolph Cancer Center y el NIH subvención P20 RR016440.

El uso de animales para la extracción de sangre fueron aprobados por el Cuidado de Animales Universidad West Virginia institucional y el empleo. Todos los experimentos fueron ejecutadas en conformidad con todas las guidelin relevanteEs, regulaciones y agencias reguladoras.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Trombina bovinaKing Pharmaceuticals, Inc60793-215-05Trombina (de origen bovino)
Cloruro de calcioKing Pharmaceuticals, Inc60793-215-05Cloruro de calcio al 10% Etanol
Sigma-AldrichE7023
IsofluranoBaxter1001936060
Caldo Mueller HintonBecton, Dickinson and Company275710
Solución salina tamponada con fosfatoSigma-AldrichD8662
Citrato trisódicoSigma-AldrichW302600
Agar de soja trípticoFisher ScientificR01202
CentrífugaKendro Productos de laboratorio 750043077
Filtro de jeringaMilliporeSLGP033RS

Referencias

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