Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas

Resumen

Se presenta un método para la reconstitución del modelo nucleosomal arrays de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas en tándem repetido. También describe cómo se utilizan los experimentos de velocidad de sedimentación en la ultracentrífuga analítica y microscopía de fuerza atómica (AFM) para supervisar el grado de saturación de gama nucleosomal después de la reconstitución.

Resumen

Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. Nucleosomal arrays se obtienen en una de dos maneras: la purificación a partir de fuentes in vivo, o la reconstitución in vitro de histonas del núcleo recombinantes y de ADN posicionamiento nucleosoma repetidas en tándem. El último método tiene la ventaja de permitir para el montaje de un uniforme más de composición y matriz nucleosomal posicionado con precisión. Experimentos de velocidad de sedimentación en la información de rendimiento ultracentrífuga analítica sobre el tamaño y la forma de las macromoléculas mediante el análisis de la tasa a la que migran a través de la solución bajo la fuerza centrífuga. Esta técnica, junto con microscopía de fuerza atómica, se puede utilizar para el control de calidad, garantizando que la mayoría de las plantillas de ADN están saturados con nucleosomas después de la reconstitución. Aquí se describen los protocolos necesarios para reconstituir cantidades de miligramos de longitud y compositivamente dnucleosomal arrays efined adecuados para los estudios bioquímicos y biofísicos de la estructura y función de la cromatina.

Introducción

Genomas eucariotas no existen como ADN desnudo, sino que más bien se compactan y organizados por proteínas unidas. Estos complejos de ADN y de proteínas se conocen como cromatina. La unidad de repetición básica de la cromatina es el nucleosoma. Un nucleosoma consta de octámero de histonas y 146 pares de bases de ADN enrollado alrededor del octámero de histonas alrededor de 1,6 veces ^1. El octámero de histona se compone de dos copias de cada uno de la H2A histonas del núcleo, H2B, H3, y H4. Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. La estructura extendida de matrices nuc....

Protocolo

1. Asamblea de recombinantes Core histonas en octamers

Justificación: El primer paso para la reconstitución array nucleosomal es preparar octamers histonas nativas de histonas recombinantes liofilizadas. Las proteínas histonas se combinan en cantidades molares iguales y se montan en octámeros histonas dializando las muestras de un tampón desnaturalizante en tampón de replegamiento.

1. Purificar y liofilizar histonas del núcleo recombinantes (H2A, H2B, H3, H4) como se describe ^13.
2. Disolver aproximadamente 5 mg de cada núcleo de histonas liofilizado en 3 ml de tampón de desarrollo (6 M de guanidina HCl, 20 mM de....

Resultados

Para ilustrar el protocolo que reconstituido nucleosomal arrays de histonas del núcleo de Xenopus recombinantes y ADN que consiste en 12 repeticiones tándem de 207 pb de la secuencia 601 de posicionamiento (601 ²⁰⁷ x 12). En primer lugar, reunido octámeros nativos de histonas del núcleo liofilizadas y después se purificó los octámeros mediante FPLC utilizando una columna S200 (Figura 1A). Complejos más grandes eluyen antes de la columna de la S200. Las histonas se eluyen generalmente.......

Discusión

Nucleosomal arrays modelo son una herramienta muy útil para el estudio in vitro de la estructura y función de la cromatina. Por ejemplo, han sido ampliamente usado para estudiar el mecanismo de la fibra de cromatina de condensación en solución ^30-34, y hecho posible la obtención de una estructura de rayos x de un Tetranucleosome ^35. Más recientemente han demostrado ser útiles en el desciframiento de los efectos estructurales de las variantes de las histonas núcleo específico, mutantes y mo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(3-aminopropil)trietoxisilano	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Tubo de diálisis	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Columna	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Concentrador centrífugo	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Tubo de diálisis	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Ultracentrífuga analítica	Beckman-Coulter