Artículo de método

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

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DOI:

10.3791/50374

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25 de junio de 2014

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1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

En este artículo

Resumen

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Resumen

Glucemia no controlada es una característica de la diabetes mellitus y promueve morbilidades como la neuropatía, nefropatía, y retinopatía. Con la creciente prevalencia de la diabetes, tanto inmune tipo 1 y relacionada con la obesidad de tipo 2, los estudios dirigidos a la delimitación de la fisiopatología de la diabetes y los mecanismos terapéuticos son de importancia crítica. Los β-células de los islotes pancreáticos de Langerhans son responsables de la secreción de insulina apropiadamente en respuesta a concentraciones elevadas de glucosa en sangre. Además de la glucosa y otros nutrientes, las células β también son estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que se secretan en el intestino en respuesta a una comida y actúan sobre los receptores de células β que aumentan la producción de monofosfato de adenosina cíclico intracelular ( AMPc). Disminución de la función de las células β, la masa y la capacidad de respuesta de la incretina son bien entendidos para contribuir a la fisiopatología de la diabetes tipo 2, y también se están cada vez más vinculados widiabetes tipo 1 ª. El presente ratón aislamiento de islotes y el protocolo de determinación de cAMP puede ser una herramienta para ayudar a delinear los mecanismos que promueven la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas, en particular los que están mediadas por los receptores de la incretina o receptores que actúan a través de la modulación de la producción de cAMP intracelular relacionado. Si bien sólo se describirán las medidas de cAMP, el protocolo de aislamiento de islotes descrito crea una preparación limpia que permite también para muchas otras aplicaciones posteriores, incluyendo la glucosa estimula la secreción de insulina, [3 H]-timidina incorporación, la abundancia de proteínas, y la expresión del ARNm.

Introducción

El mantenimiento estricto de euglucemia es imperativo para prevenir la morbilidad como la neuropatía, nefropatía y retinopatía, que son todas las características de la patología de la diabetes 1 no controlada de tipo 1 y 2. Disminución de la función de las células β y la masa, tanto en la diabetes tipo 1 y 2 perturban las concentraciones de glucosa en la sangre 2. Considerando que el tipo inmunomediada 1 diabetes resulta de una devastadora pérdida de β-células productoras de insulina, la secreción de insulina de las células β alterada y la señalización de la insulina periférica en la diabetes tipo 2 en conjunto promueven la hiperglucemia, la dislipidemia y aumento de la producción hepática de glucosa, lo que finalmente se traduce en tanto la pérdida de la capacidad de la masa de células β y secretora de insulina a partir de β-células individuales 3. La comprensión de los mecanismos de las células β subyacentes en la progresión de la diabetes tipo 1 y 2 con suerte, dará lugar a nuevas terapias para prevenir y tratar estas enfermedades.

En ti vitromodelos de cultivo ncidencia, como el INS-1 y MIN6 inmortalizados líneas de células β, pueden ser herramientas útiles para la comprensión de las funciones específicas de las células β. Sin embargo, las interacciones entre los diferentes tipos de células dentro de la isleta pueden ellos mismos regular la función de las células β. Por ejemplo, la influencia paracrina de glucagón (liberado de α-células) y la somatostatina (liberado de las células δ) en el aumento y la disminución de la secreción de insulina, respectivamente, demuestra la importancia de la proximidad de células de células en la respuesta endocrina 4. Por otra parte, los cruces brecha entre β-células potencian la liberación de insulina 5. Además, si bien se ha avanzado en la generación de líneas de insulinoma que mejor replican la respuesta fisiológica de los islotes aislados en glucosa (por ejemplo, el INS-1 derivado de 832/13 y 832/3 líneas celulares), su capacidad de respuesta de la glucosa aún difiere de rata normal islotes 6,7. Por otra parte, la respuesta de estas líneas celulares de insulinoma clonalesa péptido-1 (GLP-1) agonistas de tipo glucagón puede diferir drásticamente el uno del otro, así como de los islotes normales 6. Por lo tanto, las líneas de células inmortalizadas pueden no representar el mejor modelo para ensayar agentes que influyen en la producción de cAMP.

En contraste con las líneas celulares de insulinoma-derivado, el estudio de la función de células β únicamente en modelos animales enteros ofrece su propio conjunto de complicaciones. Uno de los mayores retos en el trabajo con el tejido endocrino es la medición de la concentración exacta de la hormona liberada. En concreto, el hígado juega un papel importante el metabolismo de la insulina, y el flujo de sangre páncreas va directamente al hígado. Por lo tanto, una medición de la insulina en plasma no puede representar con precisión las cantidades de insulina secretada por el páncreas en sí o el impacto de diferentes tratamientos sobre la tasa de secreción de insulina 8. Además, el metabolismo renal de glucagón puede limitar la fiabilidad de la producción de glucagón de las células de los islotes α-9. Por lo tanto, el aislamiento de islotes primarios de ratón para la experimentación in vitro proporciona una comprensión más precisa de cómo el islote está respondiendo a los estímulos específicos para complementar las mediciones realizadas in vivo.

El presente protocolo para el aislamiento de islotes de ratón es un protocolo bien establecido utilizado por varios grupos (con ligeras modificaciones que pueden ayudar a aumentar el éxito) 10,11. Además, la determinación de la producción de cAMP permite una lectura directa de la capacidad de respuesta de la incretina de las células β. En conjunción con la medición de AMPc, contenido de proteína y la secreción de insulina también se puede cuantificar a partir de la misma preparación de muestras de cAMP, lo que ayuda a determinar si un defecto en la función de las células β se encuentra proximal o distal a AMPc 10. El contenido de cAMP final y aplicación secreción de insulina en este protocolo puede ser una herramienta muy poderosa para la comprensión de la influencia de los componentes farmacéuticos y alimenticios, entre otross, el cAMP y la secreción de insulina. Además de la estimulación de glucosa sola, otros compuestos pueden ser utilizados para medir los cambios en el AMPc y la secreción de insulina 10,11.

Por último, aunque la insulina es la principal hormona que del ensayo de islotes aislados, otras hormonas, tales como glucagón y somatostatina, así como citoquinas, eicosanoides, y monofosfato de adenosina cíclico, puede también ser medido, ya sea mediante un ensayo de estimulación transitoria o por cuantificación de sus niveles en el medio de cultivo 12. Por último, aunque fuera del alcance de este manuscrito, aislamiento de islotes con el método de aislamiento de colagenasa descrito permite la preservación de los islotes de manera que muchas otras aplicaciones posteriores pueden llevarse a cabo, tales como el trasplante de islotes, el aislamiento de ARN para cuantitativa en tiempo real PCR o análisis de microarrays, proteínas aislamiento para el Western Blot, la incrustación de los islotes y de formación de imágenes de inmunofluorescencia, y la incorporación de [3H]-timidina como una medida de la replicación de células de islotescatiónico, algunos de los cuales se han descrito en artículos anteriores JoVE 13-16. En general, siguiendo el procedimiento de aislamiento de los islotes se describe en el protocolo puede proporcionar un investigador con información útil e importante para el desarrollo de terapias y promover el descubrimiento de medicamentos destinada a mejorar la función de las células β.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y organismos reguladores. El protocolo que se está demostrado se llevó a cabo bajo la dirección y aprobación del Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison.

1. Preparación de Soluciones

  1. El método de la eutanasia en este protocolo es desangramiento bajo anestesia Avertin (para una revisión de las alternativas, ver Discusión). Para hacer Avertin, añadir 0,625 g (1,25% o 44,2 mM) de 2-2-2 tribromoetanol a 1,25 ml de 2-metil-2-butanol en un tubo cónico de 15 ml y se calienta a 37 ° C durante 20-30 min. Agite la solución a temperatura alta durante 10 a 15 segundos a la vez para disolver completamente el 2-2-2 tribromoethanol. Una vez completamente disuelto, añadir la solución a 48,75 ml de la doble H 2 O destilada, se filtra a través de un filtro de 0,45 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml, 50 ml envolver las cónicasal tubo en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de un mes. Traiga el tubo a RT antes de inyectar ratones.
  2. Para hacer que la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), completar 1 L 1x HBSS desde un 10x (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) en doble H 2 O destilada, añadir 0,35 g (4,2 mM) Nacho 3, y la tienda a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. Para cada ratón, se requerirán 105 ml de esta solución (además de 5 a 10 ml adicionales de error pipeteo) para el aislamiento de los islotes.
  3. Los islotes son muy susceptibles al daño hipóxico; Por lo tanto, HBSS se burbujeó con 95% O2 / 5% de CO 2 para imitar las concentraciones de O 2 en la sangre. Mezclas de gases especiales se pueden comprar y una estación de burbujeo establecieron con una pipeta Pasteur conectada a un tubo flexible. Después de burbujear la cantidad requerida de HBSS con 95% O2 / 5% de CO 2 durante 15 min, añadir BSA de calidad para RIA 0,02% (albúmina de suero bovino) por volumen y mantener en hielo para la remainder del aislamiento de islotes.
  4. Para la preparación de Ficoll, pesar 32,5 g de Ficoll en un vaso de precipitados de 400 ml, añadir 80 ml de HBSS, y se agita a 500-700 rpm durante 30 min. Una vez disuelto, se vierte la solución de Ficoll en un 250 ml de cilindro graduado y añadir HBSS hasta la marca de 130 ml en el cilindro graduado para crear una solución de Ficoll 25%. Cubra la parte superior de la probeta graduada con dos porciones de Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) y agitar enérgicamente varias veces.
  5. Para una solución de Ficoll 23%, 20,5%, y 11%, añadir 27,6, 24,6, y 13,2 ml de la 25% de Ficoll, respectivamente, a 50 ml de tubos cónicos. A continuación, llevar a cada solución hasta un total de 30 ml con HBSS y agitar bien para mezclar. Las cuatro soluciones Ficoll deben almacenarse a 4 ° C y son buenos para un máximo de 2 semanas.
  6. Solución de colagenasa que es adecuado para el aislamiento de islotes activos se preparó a partir de la colagenasa aislada de Clostridium histolyticaum (mesa de Materiales). Cada lote tiene que ser probado para la eficacia de la enzima. Típicamente, la colagenasa se utiliza en 0,3-0,5 mg por ml de HBSS. La utilización de concentraciones de la enzima en ese rango (por lo general 3 concentraciones diferentes), determinar la calidad y cantidad de los islotes aislados de ratones o compañeros de camada para establecer la concentración de enzima de trabajo de la misma edad.
  7. Una vez que la concentración correcta se determina, cada ratón requiere 35 ml de colagenasa en HBSS durante todo el protocolo de aislamiento. Agitar la colagenasa en HBSS a disolverse. Inmediatamente antes de la cirugía, antes de cargar una jeringa de 5 ml con solución de colagenasa, colocar la cánula y quitar las burbujas de aire, y dejar en hielo hasta que se necesite.
  8. Los medios de cultivo de los islotes para O / N de incubación es de un RPMI 1640 suplementado medios de comunicación. Para la solución madre, disuelva una RPMI 1640 paquetes (Gibco, Nueva York) en 1 L de doble H 2 O destilada y añadir 1,19 g de HEPES (5 mM) y 2 g Nacho 3 (24 mM). Ajustar el pH a 7,4,Se esteriliza con filtro, y se almacena a 4 ° C en la oscuridad.
  9. Para los medios de comunicación complementado, añadir 10% de SFB y 100 UI/100 g / ml de penicilina / estreptomicina, respectivamente, a los valores medios RPMI 1640. Si se desea una concentración diferente de la glucosa, glucosa libre de medio RPMI 1640 y se pueden utilizar una concentración específica de la glucosa se pueden añadir.
  10. Para una población de Krebs Ringer Tampón de bicarbonato (Krebs), añadir los siguientes ingredientes para duplicar el agua destilada en las siguientes concentraciones: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), sulfato de magnesio 4 (1,18 mM), KH 2 PO 4 (1,18 mM ), nacho 3 (25 mM), HEPES (5 mM), y CaCl2 (2,52 mM) a pH 7,4. CaCl2 debe añadirse última y esta solución se puede almacenar a 4 ° C durante hasta 2 semanas.
  11. Para realizar una acción de trabajo de Krebs, primero de gas con 95% de O 2/182 5% de CO 2 durante 10-15 min con una pipeta Pasteur a 37 ° C seguido de la adición de 0,5% de BSA de calidad para RIApor volumen. A continuación, se añadió glucosa a la concentración deseada para el ensayo in vitro.

2. Preparación de Herramientas

  1. Ligeramente embotar la punta de 30 - y 27-G agujas usando una piedra de afilar para redondear la punta afilada. Ponga una curva de 45 grados en la aguja cerca de ¼ de pulgada de la punta con un par de alicates. Tenga cuidado de no apretar demasiado duro, que cerrar el diámetro interior de la aguja.
  2. Cortar el hilo 3/0 sutura de seda en aproximadamente longitudes de 4 pulgadas, una para cada ratón.
  3. Cubrir la base del microscopio de disección con plástico y cinta hacia abajo.
  4. Corta varios trozos de papel de banco absorbente, aproximadamente 3 x 5 pulgadas de tamaño, por lo menos 2 por ratón.

3. Preparación del ratón

  1. Llene una jeringa de 1 ml con 1 ml de Avertin.
  2. Se inyecta la solución Avertin por vía intraperitoneal a aproximadamente 40 l / gramo de peso corporal.
  3. Después de que el ratón no longer responde a la cola o pellizcos de las patas traseras, transfiera cuidadosamente a la estación de trabajo del microscopio de disección.
  4. Con el ratón en la posición supina y su cabeza mirando hacia distal, rocíe el ratón con etanol acuoso al 70%. Asegúrese de utilizar una cantidad adecuada de etanol al 70% para limitar la cantidad de piel en la cavidad torácica al descubierto.

4. Apertura de la cavidad torácica

  1. Apriete la piel y de la piel del ratón entre las dos patas traseras y hacer un corte inicial a través de la epidermis, la dermis y la membrana subyacente.
  2. Mientras que todavía pellizcar la piel y la membrana subyacente, cortar hacia la extremidad delantera en ambos lados del ratón teniendo cuidado de evitar el corte de cualquiera de los órganos internos.
  3. Doble la piel y la solapa membrana sobre la caja torácica y quitar el apéndice xifoides para permitir un acceso más fácil al páncreas para la inflación.
  4. Reorientar el ratón con frente a la cabeza proximal y mover los órganos internos hacia el lado derecho de la obra stación para revelar la aorta descendente.
  5. A menos que el tejido arterial se debe desechar, la aorta descendente se puede cortar para completar la eutanasia. Podrá tomar el exceso de sangre con papel de banco o un Kimwipe para facilitar el acceso a la vía biliar.

5. Al inflar el Páncreas

  1. Con un microscopio de disección, vuelva a colocar el intestino delgado por lo que el conducto biliar común forma una línea perpendicular con la cabeza del ratón.
  2. Tome una pinza y agarrar el intestino delgado y encontrar el esfínter de Oddi (esfínter de ampolla) en el extremo del conducto biliar común, que ensancha hacia fuera sobre el intestino delgado desde el conducto biliar, formando un triángulo blanco en el intestino de color rosa. Una vez que el esfínter de Oddi ha sido localizado, tómese # 5 pinzas Dumont y deslice la punta por debajo del conducto biliar común tan cerca del intestino delgado como sea posible, teniendo cuidado de no perforar el conducto.
  3. Después de la perforación a través del intestino delgado y tejido conectivo, utilizar elpunta del Dumont fórceps para agarrar el hilo de sutura y tire de ella bajo el conducto biliar común. Ate el conducto biliar común tan cerca del esfínter de Oddi como sea posible, asegurándose de que el nudo se tensa para evitar fugas.
  4. Tome ambos extremos de la sutura y tirar hacia la cola para poner un poco de tensión en el conducto biliar común. Usando una mano libre, hacer una pequeña incisión con las tijeras micro en el conducto biliar común, justo por encima de la última bifurcación en el hígado. Nota: Es importante no cortar demasiado cerca del esfínter de Oddi, ya que esto podría resultar en una inflación parcial del páncreas y evitar que se corte a través del conducto biliar común, ya que también dará lugar a una pobre inflación.
  5. Mientras mantiene los dos extremos de la cadena con el conducto biliar común tensa, retire la jeringa / cánula que ha sido pre-cargado con 5 ml de solución de colagenasa el cubo de hielo, redactada de la jeringa e inserte la aguja 30 G despuntado en el corte conducto biliar común, teniendo cuidado de no perforar la a través de la waLL del conducto. Si la aguja 30 G no es lo suficientemente ancho para la vía biliar para formar un sello alrededor, quitar y reemplazar con el romo 27 G aguja.
  6. Mientras sostiene la aguja en su lugar, liberar la sutura y recoger la jeringa de 5 ml. Lentamente presione el émbolo de la jeringa. Nota: Si la aguja se ha introducido con éxito en el conducto biliar común, se expandirá.
  7. Continuar presione el émbolo lenta y dejar fuera en una manera pulsátil hasta que la primera parte del páncreas se infla, seguido por la presión constante suave hasta que el páncreas ya no infla. Nota: La mayoría de los páncreas tienen 3-5 ml antes de empezar a gotear. Además, una inflación exitoso tendrá una distribución uniforme de tejido exocrino y la parte del páncreas en la parte superior del estómago se infla.
  8. Retire la aguja de la vía biliar común y un conjunto de al lado.

6. Eliminación Páncreas

  1. Tome unas pinzas en una mano y unas tijeras curvas enla otra. Usando las pinzas, sujete el intestino delgado en el esfínter de Oddi. Con las tijeras cerradas, utilizar la punta a parte separada del páncreas en el intestino delgado.
  2. Separe las tijeras, aparte de ampliar la brecha entre el intestino delgado y el páncreas.
  3. Coloque la "V" de la tijera, donde el intestino delgado y el páncreas se conectan entre sí en el lado derecho de la brecha que se acaba de hacer. Usando las pinzas tire suavemente el intestino delgado más allá de las tijeras para extirpar el páncreas.
  4. Seguir trabajando por el intestino delgado con el tejido conectivo de color rosa. En este punto, levante el intestino delgado cerca de donde se une con el estómago y el páncreas cortar lejos del resto del intestino delgado. Nota: Tenga cuidado de no cortar el páncreas, ya que puede empezar a desinflarse.
  5. Agarrar suavemente la parte del páncreas une al estómago con unas pinzas (fórceps planas funcionan mejor). Mientras tira suavemente del páncreas, utilizar la curvad tijeras para cortar lejos en las conexiones entre el páncreas y el estómago.
  6. Localice el bazo y sostenerlo con las pinzas por encima del páncreas. Tome las tijeras curvas y cortar las conexiones entre el bazo y el páncreas.
  7. Encuentra donde el páncreas está unido al intestino grueso. Levante el intestino grueso con unas pinzas y usar la punta de las tijeras para perforar. Extender las tijeras entre sí como antes para generar un espacio entre el intestino grueso y el páncreas.
  8. Mantenga el intestino grueso con fórceps: esto se traducirá en el páncreas caer, exponiendo sus conexiones precisas para el intestino grueso. Corta distancia de las conexiones restantes.
  9. Encontrar el tejido conectivo de color rosa adherido al páncreas y el intestino delgado y cortar tan cerca de los páncreas como sea posible. Nota: Si la perforación de la páncreas es una preocupación, se aconseja para cortar más cerca del intestino delgado como el tejido conectivo se filtró a cabo en pasos posteriores.
  10. Trab tanto del páncreas como sea posible y levantar suavemente. Con tijeras curvas, corte los contactos que persisten entre el páncreas y la cavidad torácica para eliminar totalmente el páncreas. Nota: El páncreas todavía deben ser inflados si se remueve correctamente.
  11. Almacenar el páncreas eliminado en ~ 2,5 ml de solución de colagenasa en un tubo cónico de 50 ml en hielo hasta que todos los otros páncreas han sido inflados y eliminado debido a que el experimento.

7. Lavadora

  1. Tome todos los páncreas aislados y moverlos para separar 50 ml tubos cónicos que contienen cada uno 25 ml de solución de colagenasa reciente
  2. Coloque los tubos de 50 ml cónicos rectos de un 37 ° C baño de agua agitando capaz de oscilar a 220-250 rpm, con el agitador apagado.
  3. Gas cada tubo cónico de 50 ml con 95% de O2 / 5% de CO 2 durante 5 min con una pipeta Pasteur.
  4. Vuelva a tapar cada tubo herméticamente y colocar de lado en el agua en agitaciónbaño de debajo de la superficie del agua. Agitar a 220-250 rpm durante 20 segundos, cada dos minutos, hasta 16 minutos a partir de las 6 min. (Agitar a los 6, 8, 10, 12, 14 y 16 min)
  5. Transferir inmediatamente los tubos a una centrífuga a temperatura ambiente para dar una vuelta rápida. Traiga la centrífuga hasta 1.500 rpm (400-500 g) y se apagará inmediatamente.
  6. El uso de una trampa de vacío, aspirado de alrededor de 22,5 ml de la solución de colagenasa sin perturbar el sedimento. Lavar con 10 ml de HBSS y agitar suavemente para disolver el precipitado.
  7. Realice otra vuelta rápida a temperatura ambiente hasta 1500 rpm (400-500 g).
  8. Aspirar unos 10 ml de la solución, de nuevo sin perturbar el sedimento.
  9. Lavar con otros 10 ml de hielo frío HBSS y vortex suavemente para romper de nuevo el pellet. Repita el giro y aspirado rápido 10 ml de la solución.
  10. Agite suavemente el sedimento en los restantes 2,5 ml de solución de HBSS. Verter solución a travésun 1,000 m de malla en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Esto eliminará la gran restos de tejido no digerido por la colagenasa.
  11. Enjuague el viejo tubo cónico de 50 ml con 2,5 ml de hielo frío HBSS. Utilizar una pipeta Pasteur para enjuagar los lados del tubo a fondo antes de transferir el 2,5 ml de HBSS a través de la malla en los nuevos 50 ml de tubo cónico.
  12. Realice otra vuelta rápida a temperatura ambiente a 1.500 rpm (400-500 g) para sedimentar el tejido.
  13. Aspirar todo el HBSS por la inclinación del tubo hacia la trampa de vacío. Nota: Es muy importante para no perturbar el sedimento como esto se traducirá en la pérdida de los islotes. Si la pastilla está suelto o comienza a moverse hacia la trampa de vacío, detener la aspiración de la solución y volver a sedimentar el tejido y luego continuar para aspirar la solución restante.
  14. Una vez que todo el HBSS ha eliminado, añadir 4,8 ml de solución de Ficoll 25% y agitar para disolver el precipitado.
  15. Capa con cuidado 2,4 ml de 2Solución de Ficoll 3% en la parte superior de la solución de Ficoll 25% mediante la adición de la solución de Ficoll 23% para el lado del tubo cónico de 50 ml. Para garantizar incluso en capas, girar el tubo cónico de 50 ml al añadir la solución de Ficoll.
  16. Repita el proceso de estratificación de 20,5% y luego 11% de soluciones de Ficoll. Nota: Si 4 capas distintas no están presentes, agregue HBSS hasta la marca de 50 ml y se invierta el tubo 4-6 veces o hasta que el gradiente de Ficoll ya no existe. Re-sedimentar el tejido y vuelva a intentar los pasos 07.14 a 07.16.
  17. Haga girar el tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente a 1820 rpm (800 g) durante 15 min.
  18. Vierta todo el Ficoll en un tubo cónico de 50 ml fresca, teniendo cuidado de dejar el sedimento de tejido exocrino atrás. Agregue el hielo frío HBSS hasta la marca de 50 ml y se invierta el tubo 4-6 veces para mezclar el Ficoll y HBSS juntos.
  19. Haga girar el tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente a 1820 rpm (800 g) durante 5 min.
  20. Aspirar con cuidado la mayor parte de la mezcla de HBSS / Ficoll utilizando un tra vacíop. No perturbar el sedimento ya que está suelto y se puede aspirar fácilmente.
  21. Tome una pipeta Pasteur y transferir el precipitado a un tubo de la cultura desechable.

8. Recogiendo Islotes

  1. Añadir 5 ml de medio de picking (es decir. Complementado RPMI 1640 o Krebs Ringer bicarbonato de búfer) en el tubo de la cultura desechable. Nota: Los medios de comunicación de picking variarán dependiendo de las aplicaciones posteriores.
  2. Deje que los islotes se depositan en la parte inferior del tubo de cultivo durante 5 min. Transferir utilizando una pipeta Pasteur a un 15 mm por plato Petri de poliestireno de 60 mm. Nota: Es importante utilizar una placa de Petri ya que estos no se tratan y se evitará que los islotes de adherido a la cápsula.
  3. En una separada de 15 mm por 60 mm de poliestireno caja de Petri, añadir 5 ml de medio de cultivo de los islotes de ratón (100 ml RPMI 1640 Stock Media, 10 ml FBS inactivado por calor, 1 ml penicilina / estreptomicina, filtro esterilizado).
  4. Con la ayuda de un microscopio de disección con backligcapacidad ht, utilice una pipeta P-20 para recoger los islotes en la placa de Petri que contiene los islotes medios de cultivo, teniendo cuidado de evitar la transferencia de restos de tejido acinar. Cuando a contraluz, aparecerá islotes de color marrón-oro y su membrana externa pueden brillar, mientras que el tejido acinar aparecerá de color gris claro y sin brillo. Si la preparación de los islotes contiene una gran cantidad de residuos, es aconsejable recoger a mano islotes dos veces en medio fresco. La reducción de la contaminación de los desechos limitará aglutinación islote después de una incubación durante la noche. Adición de DNAsa (3000 U / ml) al tampón de digestión también puede ayudar a limitar la formación de grumos de los islotes (JWJ, observación personal). Nota: Es importante tener en cuenta el número de islotes aislados para planificar experimentos posteriores.
  5. Incubar los islotes de O / N en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.

9. Ensayo de AMPc

  1. Etiqueta de 1,7 ml de tubos de microfuga, uno para cada repetición del ensayo. Nota: Los ensayos de cAMP deben tener por lo menos duse prefieren complica para cada condición de tratamiento, pero más repeticiones por tratamiento.
  2. Después de la desgasificación de Krebs Ringer Tampón de bicarbonato durante 15 min con 95% de O2 / 5% de CO 2 con la pipeta Pasteur, añadir 0,5% de BSA de calidad para RIA y una concentración final de glucosa de 1,7 mM (solución de preincubación). A continuación, añadir 1 ml de la Krebs recién gaseados a cada tubo de microcentrífuga. Se requieren dos ml de Krebs por tubo para los puntos de pre-incubación y tiempo de tratamiento; sin embargo se recomienda para preparar al menos 5-10 ml adicional.
  3. Agitar los islotes en el medio de la placa de Petri, y el uso de una pipeta P-20, mano-recoger los islotes a un nuevo 15 mm por 60 mm de placa de Petri de poliestireno que contiene 5 ml de la solución de preincubación para lavar el medio de cultivo que contiene glucosa- de los islotes.
  4. El kit de ensayo de cAMP utilizado es el GE Healthcare cAMP directo Biotrak EIA. El prococol utilizado es una modificación del descrito por "meas AMPc intracelulardición utilizando el procedimiento de EIA no acetilación con los nuevos reactivos de lisis, "y ha sido optimizado para su uso con el mínimo número de islotes por tubo, lo que permite un mayor número de condiciones de tratamiento y repeticiones técnica. El uso de un P-20 pipeta al menos 13 islotes en cada tubo desde el paso 9.2, manteniendo el tamaño de los islotes coherencia entre tubos, con 1 ml de tampón de pre-incubación. Nota: El aumento del número de repeticiones es más beneficioso que el número de islotes por tubo. Sin embargo, si hay suficientes islotes para aumentar el número de islotes por tubo de manera uniforme, es recomendable hacer así, hasta 25-50 islotes por tubo.
  5. Con los tapones de los tubos de microcentrífuga abierta, transferir a una incubadora a 37 ° C fijado en el 5% de CO 2 y se incuba durante 45 min a normalizar la secreción de insulina de los islotes a un nivel básico.
  6. Mientras que las muestras están incubando, preparar los tratamientos (es decir, 8 mm, 11,1 mm, 16,7 mM de glucosa, etc) en el fr Krebs gaseadosom paso 9.2. en tubos de 15 ml cónicos, con 1 ml adicionales para tener en cuenta cualquier error de pipeteado. Añadir 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) hasta una concentración final de 200 mM. IBMX es un inhibidor general de la fosfodiesterasa que bloquea la degradación de AMPc, lo que permite la acumulación de AMPc en la célula a medida que se produce. (Nota:.. Este es un verdadero ensayo de producción de cAMP, consulte la sección de discusión de casos en los que la medición de la producción de cAMP puede no ser deseable Si IBMX se deja fuera del análisis, se requerirán más islotes por tubo con el fin de obtener datos de cAMP en el intervalo lineal de la curva estándar).
  7. Después de los 45 min de preincubación, retire los tubos de microcentrífuga de la incubadora, la tapa y el pulso-vórtice cada muestra (menos de 0,5 segundos). Esto es para mezclar el gradiente de la insulina que probablemente se ha generado debido a los islotes de ser concentrada en la parte inferior del tubo. Se debe tener cuidado de no agite con demasiada dureza, ya que esto podría afectar negativamente a la estabilidad de los islotes (Nota: Convocadotubos con islotes pueden posaron o invertidas si no es posible a pulso-vórtice suavemente suavemente. Estas opciones se sumará el tiempo para el ensayo, lo que debería tenerse en cuenta al planificar el experimento).
  8. Transfiera cada tubo a una centrífuga de mesa (RT) y girar hasta que los islotes alcanzan 10.000 rpm (7,000-7500 g) y luego se apagan inmediatamente.
  9. Utilizar una pipeta P-1000 para eliminar la mayor parte de la de Krebs en cada tubo de microcentrífuga, dejando aproximadamente 10-15 l de Krebs en el sedimento de los islotes. Utilizar una pipeta P-20 para eliminar la parte más cercana el sedimento de los islotes. Si se altera de pellets, pipetear el de Krebs de nuevo en el tubo y volver a girar.
    (Nota: Si el experimentador le resulta demasiado difícil de quitar todo el Krebs del sedimento islote sin perturbarla, el último 10-15 l se puede dejar activado y representó en el volumen total más tarde en el protocolo.
  10. Obtener una cantidad adecuada de nitrógeno líquido en un recipiente aislado para romper congelar las muestras después de la incubación.
  11. Tomar las muestras de la incubadora, la tapa y agitar rápidamente (menos de 0,5 seg) girar los tubos de microcentrífuga en una centrífuga de mesa (RT) de hasta 10.000 rpm (7,000-7500 g), y luego se apaga inmediatamente. Si la insulina u otro metabolito es una aplicación aguas abajo lo desea, utilice una pipeta P-1000 para recoger una alícuota de medio en un tubo de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C hasta su posterior análisis. Si no se recogieron los medios de estimulación, que puede ser desechada.
    (Nota: IBMX es un fuerte potenciador de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de GSIS medio de estimulación de cAMP no pueden representar con precisión el verdadero efecto de los tratamientos específicos en GSIS, especialmente si estos efectos son sutiles.).
  12. Repita el paso 9.9 para quitar tanto medio de estimulación de lo posible y sin perturbar el sedimento de los islotes. Snap congelar el sedimento de los islotes en nitrógeno líquido una vez que hay menos de 10-15 l de Krebs a la izquierda en el sedimento de los islotes. Una vez que todo elLas muestras han sido instantánea congelada, almacenar a -80 ° C hasta la medición de cAMP.
  13. En el día de la determinación de AMPc, la preparación de los nuevos reactivos de lisis de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Añadir 200 ml de reactivo de lisis 1B a cada tubo de microcentrífuga y agitar a toda velocidad durante 30 segundos. Deje que los tubos se sientan en hielo durante 10 min, vórtex cada 2 min durante 30 segundos. (Nota: El protocolo recomienda llevar a cabo un análisis microscópico con azul de tripano para asegurar la lisis celular, pero esto no se realiza para islotes).
  14. Preparar los estándares de trabajo y establecer la microplaca EIA exactamente como se describe en el protocolo del fabricante. Después de que el sustrato de la enzima se ha incubado con la microplaca durante 30 min, realizar el paso de ácido sulfúrico 1,0 M opcional, y determinar la absorbancia de los pocillos de microplacas a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
  15. Resultados de AMP cíclico se registran como fmol / pocillo. Esto debe ser normalizado al volumen total de la muestra original (200 l + cualquierKrebs residual dejado en los islotes desde el paso 9.9). A continuación, los resultados pueden o bien ser normalizados para el número total de islotes, dando AMPc producido fmol / islote, o muestras de lisado puede ser sometida a ácido bicinconínico de ensayo de proteínas (BCA) para normalizar los resultados a la proteína celular total (dando proteína fmol / mg) . Este último se recomienda cuando los tamaños de los islotes son incompatibles entre las muestras, y puede ser un sustituto para el tamaño de los islotes. El kit de ensayo de proteínas Pierce BCA se ha utilizado con éxito en este protocolo y sólo requiere 25 ml de muestra. Las normas de la BSA deben prepararse en el reactivo de lisis 1B del kit de ensayo de cAMP.

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Resultados

Para asegurar un alto rendimiento durante el aislamiento de los islotes, las técnicas quirúrgicas descritas en el protocolo deben ser seguidos de cerca. Aunque las técnicas que aquí se presentan se adaptarán a cada laboratorio, hay algunos pasos críticos que conduzcan a un aislamiento exitoso. Con el fin de hacer que el conducto biliar común de fácil acceso, se recomienda que los órganos ser desplazados hacia el lado derecho del ratón (Figura 1). Además, esto permitirá que el páncreas se infla con una c...

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Discusión

Con el predominio de la diabetes proyectados para afectar el 7,7% de la población mundial, la obligación de aplicar técnicas de investigación novedosas es imprescindible tanto para comprender y tratar la diabetes 18. El actual aislamiento de islotes es un protocolo bien establecido utilizado para la experimentación in vitro y se ha presentado con anterioridad, con ligeras modificaciones 11,14,16. Aunque la secreción de insulina es una aplicación común aguas abajo de islotes aislados, centr...

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Divulgaciones

Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Renee L. Pasker y Harpreet K. Brar para la asistencia técnica de expertos sobre los protocolos descritos en este trabajo. Además, nos gustaría agradecer la tutoría de Christopher B. Newgard en la Universidad de Duke y Alan D. Attie en la Universidad de Wisconsin-Madison, junto con el apoyo de los miembros de su laboratorio, que nos permitió el tiempo y el apoyo necesarios para optimizar la protocolos descritos. En particular, agradecemos a Hans Hohmeier, Danhong Lu, y Helena Winfield en el Laboratorio Newgard y María Rabaglia en el Laboratorio Attie para los debates y asesoramiento de producción. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DK080845 y Diabetes Juvenil 594
Fundación de Investigación de subvención 17-2011-608 (a MEK)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colagenasa de Clostridium histolyticum adecuada para aislar islotes activosSigma-AldrichC7657
Ficoll 400Sigma-AldrichF9378
Hanks Solución salina equilibrada 10XInvitrogen (Gibco)14065-056
HEPESSigma-AldrichH3375
RPMI 1640 (polvo)Invitrogen (Gibco)31800-022
Albúmina de suero bovino (BSA)Sigma-AldrichA7888
3/0 Hilo de sutura de sedaFine Science Tools18020-30
Dumont #5 PinzasFine Science Tools11251-10
Pinzas de 0,8 mm   Herramientas de ciencia fina11050-10
Tijeras curvasHerramientas de ciencia fina14061-10
Vannas-Tü bingen Tijeras de resorte - Recto/Afilado/8,5 cm/5 mm Filo de corteFine Science Tools15003-08
Tijeras de disecciónFine Science Tools14002-14
5 ml BD Luer-Lok JeringaBD 309646
30 G Aguja BD 1/2" LongitudBD305106
27 g Aguja BD 1/2" LongitudBD305109
Piedra de afilarHerramientas de ciencia fina29008-01
2-2-2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402-25G
2-metil-2-butanolSigma-Aldrich240486-100mL
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Cloruro de potasioSigma-AldrichP3911
Fosfato monopotásico (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Bicarbonato de sodio (NaCHO3)Sigma-AldrichS6014
CaCl2· 2H2OSigma-AldrichC3881
MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM9397
Penicilina-EstreptomicinaInvitrogen (Gibco)15140-122
Suero bovino fetal inactivado por calor (H.I. FBS)ScientificSH30088.03HI
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)Sigma-Aldrich5879-100MG
1 ml Jeringa BD BD 309628 fisher

Referencias

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