Utilizamos muestras de la retina de retinectomía para un análisis transcriptomic de desprendimiento de retina. Hemos desarrollado un procedimiento que permite la conservación de RNA entre los bloques quirúrgicos y el laboratorio. Se estandarizó un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación en cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de microarrays.
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Artículo de método
Análisis Transcriptomic de especímenes quirúrgicos retina humana usando Diario
En este artículo
Resumen
Resumen
El desprendimiento de retina (DR) describe una separación de la retina neurosensorial del epitelio pigmentario de la retina (RPE). El RPE es esencial para la función normal de las neuronas sensibles a la luz, los fotorreceptores. Desprendimiento de la retina de la RPE crea una brecha física que se llena con el fluido extracelular. RD inicia los eventos adversos celulares y moleculares que afectan tanto a la retina neurosensorial y el EPR ya que el intercambio fisiológico de iones y metabolitos se ve gravemente perturbado. La consecuencia para la visión está relacionada con la duración de la separación desde una rápida reapposition de los dos tejidos en los resultados de la restauración de la visión 1. El tratamiento de la RD es exclusivamente quirúrgico. La eliminación del gel vítreo (vitrectomía) es seguido por la eliminación no parte esencial de la retina alrededor de la zona individual para favorecer el desprendimiento de retina. Las muestras de retina retirados son res nullius (nada) y por lo tanto normalmente se desechan.Para recuperar el ARN de estas piezas quirúrgicas, desarrollamos el Diario procedimiento que permite la conservación de ARN durante la transferencia del bloque quirúrgico para el laboratorio. También estandarizado un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de la expresión génica global. La calidad del ARN fue validado tanto por RT-PCR y análisis de microarrays. El análisis de los datos muestra una participación simultánea de la inflamación y degeneración de los fotorreceptores durante RD.
Introducción
El principal objetivo terapéutico en desprendimiento de retina (DR) es encontrar una manera de limitar el daño celular y la inflamación de la retina fotorreceptor resultante de la separación de los fotorreceptores de las células epiteliales pigmentadas de la retina. Durante RD, las células de RPE se activan, migran, dedifferentiate, y proliferan en la superficie de la retina desprendida, ejerciendo fuerzas contráctiles que conducen a complicaciones. Análisis Transcriptómica de RD es una manera de identificar los genes diana con la expresión modificada como consecuencia de RD y por lo tanto las futuras moléculas terapéuticas que podrían mejorar el resultado visual fin....
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Protocolo
1. Diario: Procedimiento para recuperar las muestras del Bloque Quirúrgico
En el laboratorio
- Obtenga un contrato de importación de la empresa de transporte expreso.
- Llenar 10 (o 25) Formas de envío a la dirección postal del laboratorio que indica la persona de contacto en el laboratorio (número de teléfono y dirección de correo electrónico).
- Preparar 10 (o 25) formas muestras numeradas del 1 al 10 (o 25). Estas formas incluyen espacios dedicados a informar sobre: a) la identificación anónima del paciente, b) la fecha de la cirugía y c) cualquier observación complementaria que el cirujano le gustaría añadir. P....
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Resultados
El procedimiento de auditoría (Figura 1) permite recuperar muestras de retina del bloque quirúrgico para ARN purificado, y para analizar el transcriptoma de desprendimiento de retina. Resultados de desprendimiento de retina en la regulación al alza de la quimiotáctica de monocitos MCP1 gen CCL2, y en la disminución de la expresión de la varilla fotorreceptor transducir gen GNAT1, el cono de onda corta opsina OPN1SW, y la homeogene CRX (Figura 2). La i.......
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Discusión
El desarrollo de un procedimiento para la recuperación de los tejidos del bloque quirúrgico ha sido esencial para el análisis del transcriptoma de desprendimiento de retina. Uno debe darse cuenta de que este tipo de cirugía se practica en situaciones de emergencia y que el operativo oftalmólogos tienen poco tiempo para participar en un programa de investigación biológica cuando operan. Este retinectomía también se lleva a cabo estocásticamente en cada servicio, por lo que la forma más fácil de llegar a un número estadís.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a Sacha Reichman y Dominique Santiard-Baron por su ayuda en la edición del protocolo de purificación de RNA.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Centrífuga | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrífuga | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Fuente de alimentación | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Suministrado con PT-DA 2105:2 |
| Dispositivo de electroforesis en gel de agarosa | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml tubo de polietileno estéril | Greiner | 115261 | |
| Tubo de centrífuga de polialómero estéril | Beckman Coulter | 331372 | |
| Reactivos químicos | Sigma | Grado de biología molecular (productos libres de ARNasa y DNasa) | |
| Solución de limpieza Chip | RBS | VWR | |
| Affymetrix | Human U133 plus 2 |
Referencias
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A d....
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Reimpresiones y permisos
