La aplicación de un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA ensayo de protección de visualizar Estrés Mediación propiedades de la proteína Dps

Vlad O. Karas; Ilja Westerlaken; Anne S. Meyer

doi:10.3791/50390

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Artículo de método

La aplicación de un

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DOI:

10.3791/50390

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31 de mayo de 2013

Vlad O. Karas¹ , Ilja Westerlaken¹ , Anne S. Meyer¹

¹Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

En este artículo

Resumen

La proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS) desempeña un papel crucial en la lucha contra el estrés bacteriano. Este artículo aborda la purificación de E. coli AD y el protocolo para un In vitro Ensayo que demuestra la protección AD-mediada de ADN de la degradación por las especies reactivas de oxígeno.

Resumen

El estrés oxidativo es un subproducto inevitable de la vida aeróbica. El oxígeno molecular es esencial para el metabolismo terrestre, sino que también participa en muchas reacciones perjudiciales dentro de organismos vivos. La combinación de metabolismo aeróbico y el hierro, que es otro compuesto vital para la vida, es suficiente para producir radicales a través de la química de Fenton y degradar los componentes celulares. La degradación del ADN es sin duda el proceso más dañino que implica radicales intracelulares, como la reparación del ADN está lejos de ser trivial. El ensayo presentado en este artículo ofrece una técnica cuantitativa para medir y visualizar el efecto de las moléculas y enzimas en el daño del ADN mediada por radicales.

El ensayo de protección de ADN es una herramienta sencilla, rápida y robusta para la caracterización in vitro de las propiedades protectoras de las proteínas o productos químicos. Se supone la exposición de ADN a una reacción oxidativa perjudicial y la adición de concentraciones variables del compuesto de interés. La reducción o el aumento de daño en el ADN como una función de la concentración de compuesto a continuación, se visualizaron mediante electroforesis en gel. En este artículo se demuestra la técnica del ensayo de protección de ADN mediante la medición de las propiedades protectoras de la proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS). DPS es un mini-ferritina que es utilizado por más de 300 especies de bacterias para combatir poderosamente estresores ambientales. Aquí presentamos el protocolo de purificación AD y las condiciones de ensayo optimizados para evaluar la protección del ADN por AD.

Introducción

Los organismos aeróbicos deben enfrentarse constantemente con especies reactivas de oxígeno que pueden dañar su ADN, así como otras macromoléculas biológicas cruciales. Una herramienta potente para contrarrestar los efectos tóxicos de daño oxidativo es la proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS). Desde su descubrimiento en 1992 del hambre E. coli cultura ^1, AD se ha identificado en más de 300 especies de bacterias y arqueobacterias ^2. Regulación al alza masiva de AD durante la fase estacionaria la convierte en la más alta expresión de proteínas nucleoid asociada de E. coli bajo condiciones de hambre ^{3, 4.}