La proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS) desempeña un papel crucial en la lucha contra el estrés bacteriano. Este artículo aborda la purificación de E. coli AD y el protocolo para un In vitro Ensayo que demuestra la protección AD-mediada de ADN de la degradación por las especies reactivas de oxígeno.
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En este artículo
Resumen
Resumen
El estrés oxidativo es un subproducto inevitable de la vida aeróbica. El oxígeno molecular es esencial para el metabolismo terrestre, sino que también participa en muchas reacciones perjudiciales dentro de organismos vivos. La combinación de metabolismo aeróbico y el hierro, que es otro compuesto vital para la vida, es suficiente para producir radicales a través de la química de Fenton y degradar los componentes celulares. La degradación del ADN es sin duda el proceso más dañino que implica radicales intracelulares, como la reparación del ADN está lejos de ser trivial. El ensayo presentado en este artículo ofrece una técnica cuantitativa para medir y visualizar el efecto de las moléculas y enzimas en el daño del ADN mediada por radicales.
El ensayo de protección de ADN es una herramienta sencilla, rápida y robusta para la caracterización in vitro de las propiedades protectoras de las proteínas o productos químicos. Se supone la exposición de ADN a una reacción oxidativa perjudicial y la adición de concentraciones variables del compuesto de interés. La reducción o el aumento de daño en el ADN como una función de la concentración de compuesto a continuación, se visualizaron mediante electroforesis en gel. En este artículo se demuestra la técnica del ensayo de protección de ADN mediante la medición de las propiedades protectoras de la proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS). DPS es un mini-ferritina que es utilizado por más de 300 especies de bacterias para combatir poderosamente estresores ambientales. Aquí presentamos el protocolo de purificación AD y las condiciones de ensayo optimizados para evaluar la protección del ADN por AD.
Introducción
Los organismos aeróbicos deben enfrentarse constantemente con especies reactivas de oxígeno que pueden dañar su ADN, así como otras macromoléculas biológicas cruciales. Una herramienta potente para contrarrestar los efectos tóxicos de daño oxidativo es la proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS). Desde su descubrimiento en 1992 del hambre E. coli cultura 1, AD se ha identificado en más de 300 especies de bacterias y arqueobacterias 2. Regulación al alza masiva de AD durante la fase estacionaria la convierte en la más alta expresión de proteínas nucleoid asociada de E. coli bajo condiciones de hambre 3, 4. Además, DPS ha sido demostrado para preservar tanto la viabilidad bacteriana y la integridad del ADN durante muchas diversas tensiones, entre ellos el hambre, alta concentración de hierro, exposición a la luz UV, choque térmico, y el estrés oxidativo 5, 6.
Estructuralmente, DPS libre asociados a un complejo homo-oligómero estable de 12 monómeros, which montar en una cáscara hueco esférico. El ~ 4,5 nm en toda la cavidad interna es accesible para el disolvente a través de poros que permiten el paso de pequeñas moléculas de 7 exterior, y que es capaz de secuestrar metales mineralizados tales como hierro 8. El efecto protector de la AD se deriva de sus varias actividades bioquímicas, que incluyen ADN no específico de unión 1, la actividad ferroxidasa, y almacenamiento de hierro 8.
Estudio detallado de las actividades bioquímicas beneficiosos de AD requiere primero su purificación. AD purificación es un procedimiento elaborado, como AD deben estar separados no sólo a partir de otras proteínas, sino también de cualquier ADN unido 7. Nuestro proceso de purificación optimizado utiliza muchas técnicas comunes, que consiste en dos columnas de intercambio iónico y un paso de precipitación con sulfato de amonio. Se necesitan varios cambios de tampón, como AD altamente concentrados pueden precipitar fuera de la solución en condiciones de poca sal. Una vez que la proteína AD ha sido purificada, Que puede aplicarse a ensayos que miden directamente su actividad ferroxidasa 8, la estequiometría de unión a ADN 9, y los mecanismos de fijación de hierro 10. Dps purificada también tiene otras aplicaciones potenciales. La estructura esférica hueca estable de AD se ha utilizado como andamio para el almacenamiento de partículas hidrófobas dentro de la cavidad proteína 11 e incluso como una cámara de reacción para sintetizar nuevas nanopartículas magnéticas 12.
La capacidad protectora de AD para mediar los daños debidos a las especies reactivas de oxígeno puede ser clara y demostrada directamente mediante el ensayo de protección de DNA 13, 14. En este procedimiento in vitro, especies de radicales se producen cuando el hierro cataliza H 2 O 2 a través de la degradación química de Fenton. Estos radicales dañan directamente el ADN presente en la reacción y pueden degradar completamente a altas concentraciones. Dos actividades principales Dps pueden tanto contrarrestar directamente los efectos de Fenten la producción de radicales mediada. AD reduce la concentración de hierro catalítico a través de la mineralización, consumiendo el peróxido de hidrógeno disponible en el proceso. Además, AD unión al ADN potencialmente pueden protegerlo físicamente del daño de los radicales y lo condensa en un volumen más pequeño, con menos superficie reactiva. La combinación de estas dos propiedades hace que el ensayo de protección de ADN muy adecuado para el propósito de medir la actividad protectora AD.
El ensayo de protección de ADN es muy versátil y se puede utilizar para una variedad de aplicaciones más allá de AD caracterización. Daño de los radicales es una forma común de estrés en las células, y muchas proteínas y productos químicos diferentes se utilizan para contrarrestarlo. El principio general del ensayo, el uso de la integridad del ADN como un marcador para el daño de los radicales, se puede utilizar en combinación con casi cualquier reacción de radicales-productora o agente de contrarresto. Entre otros, el ensayo ha sido utilizado con éxito para determinar las propiedades anti-oxidantesde K. Extracto paniculata para su uso en la industria alimentaria 15, para caracterizar los efectos del ácido úrico en el daño hidroxilo mediación 16, y para obtener nuevos conocimientos sobre la función de la piel de la transcripción proteínas reguladoras 17.
A pesar de los numerosos usos del ensayo en los trabajos publicados, se encontró que eran necesarios muchos optimización y solución de problemas, lo que hace que la configuración del ensayo por primera vez un proceso innecesariamente laborioso para muchos investigadores. El protocolo que presentamos en este artículo tiene como objetivo eliminar esta barrera para la entrada.
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Protocolo
1. Dps Expresión y purificación
La obtención de proteína de alta pureza es un primer paso esencial para el ensayo de protección de ADN. La purificación de la proteína Dps se puede realizar en 4 a 5 días.
- Transformar una cepa deficiente en proteasa de E. coli (tal como BL21 (DE3) pLysS) con un vector pET (tales como pET17) en el que la secuencia que codifica la proteína Dps ha sido clonado.
- Racha de las células transformadas a cabo en placas de agar Luria Broth (LB) que contienen los antibióticos apropiados (tales como ampicilina y cloranfenicol para los ejemplos proporcionados en 1.1). Las placas se incuban durante la noche a 37 ° C.
- Se inocula una sola colonia de la placa en 30 ml de medio LB que contenía los antibióticos apropiados. Incubar toda la noche a 37 ° C con agitación a 200-250 rpm.
- Inocular 2 x 1 L de medio LB que contiene antibióticos apropiados con 10 ml de cada uno de los cultivo de una noche. Crece a 37 ° C, mientras se agita, a OD 600 de aproximadamente 0,6. (Cultivo células para producción de proteína aumenta OD más alto, sin comprometer notablemente la pureza del producto final.) Inducir la expresión de la AD mediante la adición de IPTG a una concentración de 0,3 mM, y se incuba a 37 ° C durante 3-4 horas mientras se agita.
- Células de la cosecha por centrifugación a 6000 xg durante 15 min. Resuspender los sedimentos de células en 7,5 ml de DEAE tampón A (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,1 mM EDTA) por litro de cultivo celular inducida. Las muestras pueden ser congeladas en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C, si se desea. El procedimiento puede entonces continuarse por descongelar las muestras en un baño de agua a 4 ° C.
- Añadir una mezcla de inhibidores de la proteasa (Calbiochem, tales como inhibidores de la proteasa conjunto III, en 0.167 l por ml de suspensión de células) a la suspensión celular para impedir la degradación de AD sobreexpresados.
- Preparar extracto libre de células usando una prensa francesa. Cebe la prensa francesa con 20 ml de DEAE Buffer A (si se utiliza un modelo de flujo continuo), entonces disrupciónt de la muestra dos veces en 20 kpsi. Se centrifuga el lisado a 30.000 xg durante 35 min a 4 ° C para aclarar las partículas insolubles, y guardar el sobrenadante. El sobrenadante puede ser entonces congelada utilizando nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C, si se desea.
- Se equilibra una columna de 30 ml de DEAE Sepharose CL-6B de DEAE con tampón A, usando una FPLC. Ejecutar tampón a través de la columna a 1-2 ml / min con una presión máxima de 0,2 MPa sobre el fondo. Cargar el extracto libre de células en la columna, y comenzar a recoger el flujo a través de-una vez que la señal de OD 280 comienza a aumentar por encima de línea de base. Lavar la columna con DEAE tampón A hasta que el valor de la DO 280 vuelve a la línea de base, mientras que continuamente recoger el flujo a través. El flujo a través deben contener la mayoría de la proteína Dps, libre de ADN unido. Lavar la columna con 100% de tampón B (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M de NaCl, 0,1 mM de EDTA). Este eluido contiene complejos AD-ADN, así como otras proteínas y puede ser desechada.
- Eliminar publicidadcontaminar condicional proteínas a través de precipitación con sulfato amónico. Determinar el volumen combinado de flujo continuo. Lentamente (durante un período de 10-20 min) añadir sulfato de amonio a pequeña grano seco a la saturación de 62% (390 mg por ml de solución) a 4 ° C mientras se agitaba bien. Se agita la mezcla durante un adicional de 20-30 minutos después de la adición de la última porción de sulfato de amonio para asegurar equilibrio completo. Dps permanecerán solubles, mientras que las proteínas contaminantes sin precipitar fuera de la solución.
- Eliminar las proteínas precipitadas por centrifugación a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C y guardar el sobrenadante.
- Poco a poco agregue un sulfato amónico 227 mg adicionales por ml de sobrenadante para alcanzar la saturación del 94% y se agita durante 20 a 30 minutos para asegurar el equilibrio completo. Dps precipitados en esta alta concentración de sal y pueden ser recogidos por centrifugación a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. AD estarán en el sedimento, el sobrenadante puede ser desechada. El sedimento se puede almacenar a -80 ° C si desired.
- Resuspender el sedimento que contiene AD-resuspensión en tampón (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA). Ajuste el volumen de la muestra de 2,5 ml.
- El cambio de tampón para eliminar el sulfato de amonio mediante el uso de una columna de filtración en gel PD-10. Equilibrar el lecho de gel con 25 ml de tampón de resuspensión. Aplique el 2,5 ml de AD muestra en la parte superior de la columna de PD-10 y deje que penetre en su interior Deseche el flujo continuo. Recoger AD eluyendo con 3,5 ml de tampón de resuspensión.
- Centrifugar el intercambio de tampón de la muestra a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los componentes insolubles, y diluirlo con 6-10 ml de tampón de dilución (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, EDTA 0,1 mM) para asegurar que el concentración de sal es lo suficientemente bajo como para AD para unirse a la columna de Sepharose SP. En particular, las muestras concentradas de AD pueden llegar a ser menos soluble tras la dilución en un tampón de menor contenido de sal, como se evidencia por la nubosidad de líquido, pero pueden ser completamente resolubilizada por la adición de una pequeña amount de solución 5 M de NaCl (un adicional de 10-20 mM).
- Se equilibra una columna de flujo de 30 ml de SP Sepharose Fast SP con tampón A (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA). Ejecutar tampón a través de la columna a 1,5-2 ml / min con un límite de presión de 0,3 MPa sobre el fondo. Cargar la muestra en la columna. Lavar con SP tampón A hasta que las declaraciones traza OD 280 de línea de base, y desechar el flujo continuo. Ejecutar un gradiente lineal de 150 ml de 0 a 100% de tampón B, mientras que la recogida fracciones de 2 ml. AD se eluyen en un pico agudo en torno al 50% de B, aunque la variación en un 10% es posible.
- Ejecute las fracciones de elución en un gel SDS-PAGE al 15%, y comprobar la contaminación de ADN mediante la medición de los 260/280 OD relación OD usando un espectrofotómetro. El gel sólo debe mostrar una banda de alrededor de 19 kDa, y el OD 260 / OD 280 es típicamente alrededor de 0,7. Piscina para los más puros fracciones de DPS. Utilice una unidad de filtro centrífugo (tal como la unidad de filtración Amicon Ultra) con un10K peso molecular de corte para concentrar las DPS y cambiarlo en un tampón de almacenamiento (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Alícuotas de las AD purificados, y congelar en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80 ° C.
2. Ensayo de protección del ADN
El ensayo implica múltiples pasos sensibles al tiempo y debe programarse a la segunda para obtener resultados reproducibles. Muchos de los ingredientes y los pasos de pipeteado están involucrados, por lo que una mesa de pipeteado (ver Tabla 1) se recomienda realizar un seguimiento de las medidas y volúmenes. El tiempo total requerido para el ensayo es de no más de 3 horas.
- Medir 30 ml de agua en un frasco hermético; enjuagar el agua con N2 durante 10 min (utilizando dos agujas de jeringa, una en el fluido, una encima de la misma) para eliminar el oxígeno de la solución. Añadir 0,0168 g FeSO4 • 7H 2 O para el agua para obtener una solución madre 2 mM. Sellar el frasco y enjuague con nitrógeno durante 5 minutos más, luego mezclar. La solución debe serclaro, si cualquier atisbo de amarillo es detectable, preparar una nueva solución de hierro.
- Hacer un 100 mM H 2 O 2 solución (10,87 l de 9.2MH 2 O 2 en 1 ml de agua); mantener en hielo y protegida de la luz, envolviendo en papel de aluminio. Utilice sólo durante 1-2 horas después de la preparación debido a la descomposición espontánea. El stock de peróxido de hidrógeno es similar sujeto a la ruptura, que puede estar parcialmente mejorado por almacenamiento adecuado (en la oscuridad, a 4 º C). Se recomienda la comprobación periódica de la concentración stock de medición de los 240 OD.
- Descongelar una alícuota de AD purificada rápidamente en un baño de agua a temperatura ambiente, y mantener en hielo. Centrifugar durante 10 segundos a 4000 xg en una tapa picocentrifuge mesa para agregados precipitado. Medir la concentración después de la centrifugación usando un espectrofotómetro (DO 280 = 1,547 indica una concentración de 100 AD monómero mu M).
- Diluir el ADN lineal de alta concentración madre usando 12x tampón de reacción (1M MOPS-KOH pH 7,0, NaCl 1 M) a una concentración de 100 ng / l. ADN lineal se utiliza para hacer más fácil cuantificación, pero el ADN plásmido puede ser utilizado también.
- Pipetear 1 l de la mezcla de ADN-tampón en un tubo de PCR. Añadir suficiente agua en la reacción de modo que el volumen final de reacción (menos SDS) será de 12 l. Este importe debe calcularse con antelación utilizando la tabla de pipeteo. Añadir AD a una concentración dodecámero final de 3 mM. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente para permitir la AD a se unen al ADN.
- Añadir suficiente mM de solución de FeSO4 2 para llegar a la concentración deseada. Un experimento típico utiliza una gama de concentraciones de 0 a 1 mM FeSO 4. Las concentraciones más altas causarán más extensa degradación del ADN, pero también pueden conducir a la formación de férrico precipita en la mezcla de reacción. Añadir rápidamente 1 l de la solución 2 mM de H 100 O 2 (a concentración final 10 mM), y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min para permitir que el FentonMediada por reacción de degradación a tener lugar.
- Añadir 0,8 l de 20% de SDS (dodecil sulfato de sodio). Mezclar e incubar a 85 ° C durante 5 min para alterar los complejos de ADN-AD. El SDS desestabiliza el complejo AD-ADN y previene cambios no deseados de gel para el ADN, lo que mejora la facilidad de cuantificación. Un paso opcional es para detener la reacción por catalíticamente degradar el peróxido de hidrógeno en productos no tóxicos. En las condiciones descritas en este protocolo, no es necesario este paso para obtener una amplia gama de la degradación del ADN.
- Incubar en hielo durante 1 min, añadir colorante de carga, y cargar en un gel de agarosa. Ejecutar el gel, y de la mancha de ADN utilizando bromuro de etidio. El gel debe ser manchado posterior a electroforesis en lugar de antes de la electroforesis, para evitar que el SDS de interferir con la distribución de bromuro de etidio en el gel.
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Resultados
El proceso de purificación de AD descritos aquí es muy reproducible. AD purificación de acuerdo con el protocolo descrito, usando 2 l de E. cultura coli como punto de partida, típicamente darán 2,5 ml de proteína que contiene AD 12 a concentraciones entre 5 y 12 mM. Tiempos de inducción más largos (4 horas) parecen reducir esta variabilidad. Pureza proteína es constantemente por encima de 99%, como se evidencia por SDS-PAGE geles (Figura 1). El nivel de contaminación de ADN ...
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Discusión
El proceso de purificación de la AD que se describe en este artículo es muy robusto. Pureza ha sido consistentemente alto (> 99%), sin otras proteínas aparecen en geles de SDS-PAGE como bandas visibles. A pesar de esto, algunos lotes de AD purificadas parecen tener una actividad nucleasa, como se evidencia por la degradación parcial de ADN cuando se incubó con concentraciones muy altas de AD. Esto podría indicar la presencia de DNases gran actividad a bajas concentraciones que no fuimos capaces de eliminar a través d...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen y Kourosh Honarmand Ebrahimi útil para los debates. Esta labor fue apoyada con una financiación inicial de la Universidad Tecnológica de Delft.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3)Células competentes pLysS | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB caldo en polvo | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicilina sal sódica | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Hidróxido de potasio | Merck | 105033 | |
| Cloruro de sodio | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa III | EMD-MILLIPORE | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Sulfato de amonio | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Columnas de desalinización | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filtro (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Sulfato ferroso heptahidratado | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Solución de peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem Calbiochem | 475898 | |
| solución SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Bromuro de etidio | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Incubadora estática | Hettich | INE500 | |
| Incubadora de agitación | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Centrífuga refrigerada | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Centrífuga de sobremesa | Eppendorf | 5424 | |
| Disruptor de celdas | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| Purificador FPLC | General Electric | AKTA | |
| Viales herméticos | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Agujas de jeringa | BD | 305128 | |
| Pipetas | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
Referencias
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