Preparación de las células acinares pancreáticas para los fines de Imagen de calcio, Lesiones Medidas Celulares e infección viral

Resumen

Se describe un método reproducible de la preparación de las células acinares pancreáticas de ratón de un ratón con el fin de examinar las señales de calcio de células acinares y el daño celular con estímulos fisiológica y patológicamente relevantes. Un método para la infección adenoviral de estas células también se proporciona.

Resumen

La célula acinar pancreática es la principal de células de parénquima del páncreas exocrino y desempeña un papel principal en la secreción de enzimas pancreáticas en el conducto pancreático. También es el sitio para la iniciación de la pancreatitis. A continuación se describe cómo se aíslan las células acinares del tejido pancreático conjunto y señales intracelulares de calcio se miden. Además, se describen las técnicas de transfección de estas células con las construcciones adenovirales, y, posteriormente, la medición de la fuga de lactato deshidrogenasa, un marcador de la lesión de las células, en condiciones que inducen la lesión de las células acinares in vitro. Estas técnicas proporcionan una poderosa herramienta para caracterizar la fisiología y la patología de células acinares.

Introducción

Los cambios dinámicos en el calcio citosólico son necesarios para los eventos de células acinares tanto fisiológicas como patológicas. Estos efectos divergentes de calcio se cree que son el resultado de diferentes patrones espaciales y temporales de calcio de señalización ^1. Por ejemplo, la enzima y la secreción de fluidos a partir de las células acinares están vinculados a los picos de calcio a partir de una región restringida del polo apical donde la secreción tiene lugar ^2. En contraste, una onda de calcio mundial seguido de intensas señales de calcio no oscilatorios se asocia con eventos patológicos tempranos que conducen a la pancreatitis a....

Protocolo

1. Preparación de las células acinares pancreáticas de Imagen de calcio

1. Preparar HEPES tampón de incubación que contiene 20 mM de HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM de MgCl _2, 1,3 mM de _CaCl2, 10 mM de glucosa, 2 mM de glutamina, y 1 × aminoácidos no esenciales del medio mínimo de Eagle. Ajustar la solución final a pH 7,4 con NaOH.
2. Preparar un tampón de incubación de BSA mediante la adición de BSA (1% w / v final) a 25 ml de HEPES el tampón de incubación (descrito anteriormente).
3. Preparar un tampón de digestión de colagenasa mediante la adición de 1,1 mg / ml (200 unidades / ml) de colagenasa de tipo 4 y 1 mg / ....

Resultados

Un ejemplo de las mediciones del calcio de células acinares en respuesta a estímulos fisiológicos se proporciona en la Figura 3. Las células acinares se cargaron con el colorante de calcio Fluo-4 y se perfundieron con el análogo de acetilcolina carbacol (CCh; 1 M)) ^8. Las células respondieron en la forma de una onda de calcio que se inicia en la región apical y se propaga a la región basolateral ^3,9. Trazados representativos se muestran en la Figura 3B muestran el .......

Discusión

El método de aislamiento de células y ensayos posteriores representadas aquí representan poderosas herramientas con las que estudian las características fisiológicas y fisiopatológicas del páncreas exocrino. El método para aislar células acinares pancreáticas dispersos fue descrita por primera vez por Amsterdam y Jamieson en 1972 ^11. Los métodos que aquí se presentan han sido adaptados de los métodos de aislamiento más recientes descritos por Van Acker et al ^12. Aunque estas técnicas son altamente .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones	NCI	N/A	Macho 20-30 gramos; prácticamente cualquier cepa debería producir resultados comparables.
HEPES	Cloruro de sodio AB00892		bioanalítico estadounidense
	J.T. Baker	3624-05
Cloruro de potasio	J.T. Baker	3040-01
Cloruro de magnesio	Sigma	M-8266
Cloruro de calcio	Fischer	C79
Dextrosa	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamina	Sigma	G-8540
1X mínimo Mezcla de aminoácidos no esenciales medio de Eagle	Gibco	11140-050
Hidróxido de sodio	EM	SX0593
Albúmina sérica bovina	Sigma	A7906
Colagenasa	Worthington	4188
Inhibidor de tripsina de soja	Sigma	T-9003
Dióxido de carbono	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Matraz de plástico Erlenmeyer	Crystalgen	26-0005
Kit de disección	Fine Science Tools	14161-10
70% Etanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipetas	Gilson	FA10005P
Barco de pesaje	Heathrow Scientific	HS1420A
Pipetas de transferencia de plástico	USA Scientific	1020-2500
Tubos cónicos de 15 ml	BD Falcon	352095
Tubos cónicos de 50 ml	BD Falcon	352070
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher	05-408-129
Tubo de microcentrífuga de 0,65 ml	VWR	20170-293
Cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm	Fisher	032811-9
Ácido nítrico	Fischer	A483-212
Ácido clorhídrico	Fischer	A142-212
Agua desionizada	N/A	N/A
18 x 18 mm cubreobjetos	Fischer	021510-9
Película de laboratorio	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimetilsulfóxido Sigma		D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
jeringa de 60 ml	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ aguja de calibre	BD Bioscience	9328270
PE50 tubo	Clay Adam	PE50-427411
Destornillador de cabeza plana	N/A	N/A
DMEM F-12, no Rojo Fenol	Gibco	21041-025
Aguja calibre 30,5	BD Bioscience	305106
5 CC Jeringa	BD Bioscience	309603
25 ml Matraz Erlenmeyer	Fischer FB50025
Filtro de malla de nailon Nitex		03-150/38 Tamaño de	poro de 150 mmm
placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos	Costar	3548
placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Costar	3795
placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Costar	3506
Nitrógeno líquido	Matheson Gas	7727-37-9
ensayo de citotoxicidad	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Regalo de J. Williams
Equipment
Soporte de anillo con abrazaderas	United Scientific	SET462
Cámara de perifusión	N/A	N/A	Diseñado por S.Z.H y sus colegas de la Universidad de Yale
Línea de vacío	Manostat	72-100-000
Baño de agua con agitador	Precision Scientific	51220076
Microscopio confocal	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 lector de placas BioTek		11-120-534
Campana de cultivo de tejidos	Nuaire NU-425-600
Incubadora de cultivo de tejidos	Thermo	3110

kit de