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Artículo de método

Ecocardiografía Fetal y Ecografía Doppler de onda pulsada en un modelo de conejo de Restricción del crecimiento intrauterino

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DOI:

10.3791/50392

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29 de junio de 2013

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1Division Woman and Child, Department Women, University Hospitals Leuven, 2The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University, Victoria, Australia, 3Department of Cardiovascular Sciences, Katholieke Universiteit Leuven, 4Fetal and Perinatal Medicine Research Group, Institut d'Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), 5Maternal-Fetal Medicine Department, ICGON, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER)

En este artículo

Resumen

Se describe el examen de la función cardíaca fetal mediante ecocardiografía fetal funcional contemporánea y fetoplacentaria ecografía Doppler utilizando el VEVO 2100 microultrasound VisualSonics en un modelo inducida quirúrgicamente de restricción del crecimiento fetal intrauterino en un conejo.

Resumen

Restricción (RCIU) los resultados del crecimiento fetal intrauterino en la función cardíaca anormal que se desprende antes del parto debido a los avances en fetoplacentaria ecografía Doppler y la ecocardiografía fetal. Cada vez más, estas modalidades de imagen se están utilizando clínicamente para examinar la función cardíaca y evaluar el bienestar en el útero, orientándolas así calendario de las decisiones de nacimiento. Aquí, se utilizó un modelo de conejo de restricción del crecimiento intrauterino que permite el análisis de la función cardiaca de una manera clínicamente relevante. Con la anestesia inducida con isoflurano, RCIU se crea quirúrgicamente en el día 25 de edad gestacional mediante la realización de una laparotomía, dejando al descubierto el útero bicorne y luego ligar 40-50% de los buques uteroplacental abastecen cada saco gestacional en un solo cuerno uterino. El otro cuerno en el útero bicorne conejo sirve como fetos de control interno. Entonces, después de la recuperación en el día 30 de edad gestacional (a término), el mismo conejo se somete a examen de la función cardiaca fetal. La anestesia se indujo con KetamINE y xilazina por vía intramuscular, a continuación, mantenidos por una infusión intravenosa continua de ketamina y xilazina para minimizar los efectos iatrogénicos sobre la función cardíaca fetal. Una repetición de la laparotomía se realiza para exponer cada saco gestacional y se realiza un examen microultrasound (VisualSonics VEVO 2100) de la función cardiaca fetal. La insuficiencia placentaria es evidente por un índice de pulsatilidad elevado o un fin de flujo diastólico ausente o inverso de la arteria umbilical Doppler de onda. A continuación se examina el ductus venoso y la arteria cerebral media Doppler. La ecocardiografía fetal se realiza mediante el modo de grabación B, modo M y el flujo de ondas de velocidad en las vistas lateral y apical. Cálculos Desconectado determinan variables estándar en modo M cardíacas, anular excursión sistólica del plano tricúspide y mitral, speckle tracking y análisis de tensión, el índice de rendimiento miocárdico y vascular modificado la velocidad de flujo de onda de interés. Este modelo animal pequeño de RCIU tanto permite examinar en utero la función cardíaca que es consistente con la práctica clínica actual y por lo tanto es útil en un contexto de investigación traslacional.

Introducción

La carga de la enfermedad cardiovascular que resulta de la restricción del crecimiento fetal intrauterino (RCIU) no puede ser exagerada. Es la principal causa de muerte fetal después de anomalías congénitas. 1 RCIU se refiere a un feto que no llega a su potencial de crecimiento y es comúnmente el resultado de la insuficiencia placentaria. 2 En los sobrevivientes, mala salud cardiovascular es evidente a través de la duración de la vida con la disfunción miocárdica aparente en la infancia y la niñez 3,4 y posterior hipertensión 5, 6 diabetes y la obesidad en desarrollo en la vida adulta - todos los factores de riesgo cardíacos acumulados desde el nacimiento a la muerte prematura por enfermedad isquémica del corazón 7.

El desarrollo de modelos animales para caracterizar la comunicación materno-fetal que establece restricción del crecimiento intrauterino y la respuesta fetal posterior a la reducción de la disponibilidad de sustrato es necesario si queremos entender tanto mejor la fisiopatología de coche RCIU relacionadosinsuficiencia cardíaca y para desarrollar estrategias que ayudan a proteger a mejorar la salud fetal y postnatal. En este sentido, se han descrito muchos modelos diferentes a través de diferentes especies. 8 RCI comúnmente se induce por la desnutrición materna con una dieta baja en proteínas en los roedores, 9 ablación quirúrgica o ligadura de flujo sanguíneo uterino en roedores y conejillos de indias 10 o la oclusión de la arteria umbilical en el ganado ovino. 11 Sin embargo, es evidente que no hay un modelo completamente recapitula la IUGR humana. 12

En este estudio metodológico actual, se utilizó un enfoque bien validado de interrupción vascular uteroplacentario selectiva en un conejo 13-16 que no sólo produce respuestas cardiovasculares fetales observadas clínicamente con ultrasonido 14, sino que también permite la interrogación de la función cardiaca fetal con ecocardiografía novedoso uso de la tecnología microultrasound del VisualSonics VEVO 2100. Si bien la ecografía Doppler de fetoplvasos acental sigue siendo la piedra angular de la actual vigilancia prenatal de fetos con RCIU 17, ecocardiografía funcional cada vez se utiliza para proporcionar nuevos conocimientos sobre fisiopatología de la enfermedad y para evaluar el bienestar fetal. 18 En consecuencia, aquí tomamos estos avances de la investigación clínica y describe un modelo animal que puertos no sólo esta sofisticación de imágenes sino que también proporciona la plataforma experimental para investigar las vías mecanicistas y la terapéutica.

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Protocolo

El protocolo experimental siguiente es aprobado por el Comité de Ética Animal, Universidad Católica de Lovaina, Lovaina, Bélgica. Seguimos descrito previamente 13 Procedimiento quirúrgico que incluye algunos cambios metodológicos, especialmente en el procedimiento de anestesia.

1. La inducción del Crecimiento Intrauterino (RCIU)

  1. Hora de fecha conejas preñadas (híbridos Dendermonde y Nueva Zelanda Blanco) están alojados en jaulas individuales en un horario de luz 12/12 horas con acceso al agua y el conejo comida estándar ad libitum de la edad gestacional (GA) 18 días. En GA 25 días (a término es de 31 días aproximadamente), los conejos se transfieren a la sala de operaciones para la creación quirúrgica de RCIU. Antes de la cirugía, asigne al azar un "caso" (RCIU) y "control" cuerno uterino en el útero bicorne conejo utilizando software aleatorización (GraphPad Software, EE.UU.) 19. Tamaño de la muestra debe ser determinado por los cálculos de potencia por r individuoos investigadores de la cuestión de los intereses.
  2. Procedimiento Anestesia.
    Inducción de la anestesia se consigue mediante la administración de ketamina 35 mg / kg (Ceva Santé Animale, Bruselas, Bélgica) y xilazina 5 mg / kg (Ceva Santé Animale, Bruselas, Bélgica) por vía intramuscular en la pata trasera. La anestesia se mantiene a continuación con una mezcla de inhalación de 1-4% de isoflurano (Isoba Vet; Abbott Laboratories Ltd., Queenborough, Kent, Reino Unido) en O 2 a 2 l / min. Coloque un oxímetro de pulso (Nellcor N-20, Covidien, Irlanda) en el segundo y tercer dedo del pie materna para monitorear continuamente la frecuencia cardíaca y la saturación arterial de O 2.
  3. Procedimiento quirúrgico.
    1. La premedicación. Antes de comenzar la cirugía, administrar profilaxis antibiótica penicilina G, 300 000 UI (Kela Pharma, Hoogstraten, Bélgica), uterina acetato de medroxiprogesterona tocolítico 0,9 mg / kg (Depo-Provera, Pharmacia Upjohn, Puurs, Bélgica) y la buprenorfina analgésica 0,03 mg / kg (Temgesic, Schering-Plough) Por vía subcutánea en una sola jeringa de 2,5 ml.
    2. Preparación del conejo. Coloca el conejo sobre una almohadilla de calentamiento durante la duración de la cirugía. Retire el cabello del campo quirúrgico abdominal y aplicar antiséptico povidona-yodo 7,5% (Betadine, Purdue, Connecticut, EE.UU.). Un protocolo aséptica completa a continuación, se emplea.
    3. Laparotomía abdominal. Infíltrate en la zona de la incisión con anestesia local (2 ml de lidocaína al 1%, B Braun Medical, Bélgica) por vía subcutánea. El sitio de la incisión debe ser de aproximadamente 5 cm de longitud en la línea media, en la 2/3 inferiores del abdomen. Una vez que se abre la piel, utilizar una mezcla de disección precisa y roma para exponer la vaina del recto. Se debe tener cuidado para evitar las glándulas mamarias maternas vasculares situadas a ambos lados de la línea media de la entrada (Figura 1A). Sujete la vaina del recto y el peritoneo, tienda de evitar la inclusión accidental del contenido del abdomen e introduzca cuidadosamente con disección cortante (Figura 1B).
    4. Exteriorización uterina. Envolvente del campo quirúrgico con cortinas de gasa empapada en solución salina calentada. Sujete cuidadosamente y exteriorizar ambos lados del útero bicorne. Hay que tener cuidado de no colocar bien el vaginal o el final de ovario de cada cuerno uterino bajo tensión, ya que esto puede dar lugar a sangrado no deseado, el dolor y la contractilidad uterina. El asistente de irriga continuamente el útero expuesta con solución salina calentado para prevenir las contracciones uterinas. Palpar y registrar el número de fetos presentes en cada cuerno. Por convención, el feto al final de ovario se designa el primer feto. Un cuerno uterino es la bocina y otro caso es el cuerno de control. Identificar el cuerno caso anteriormente asignados al azar para la inducción de retraso del crecimiento intrauterino y luego vuelva a colocar la bocina de control en el abdomen (fetos de control interno).
    5. Quirúrgicamente inducida RCIU. Identificar los vasos uteroplacental a cada saco gestacional en el cuerno caso señalado (Figura 1C).Ligar quirúrgicamente 40-50% de estos buques que utilicen una sutura de poliglactina (Vicryl Ethicon, Johnson & Johnson Medical, EE.UU.) 5-0 (figuras 1D-1E). En la práctica, a menudo hay tres haces vasculares que suministran cada saco gestacional. En este caso, el haz vascular más grande se ligó. Una vez completa, el útero está otra vez irrigada con solución salina calentada y cuidadosamente devuelto al abdomen.
    6. Cierre abdominal. Cierre el abdomen en dos capas utilizando un funcionamiento continuo 2-0 sutura de poliglactina (Vicryl Ethicon, Johnson y Johnson Medical, EE.UU.). Cierre la piel con sutura subcuticular 3-0 poliglactina (Vicryl Ethicon, Johnson & Johnson Medical, EE.UU.). Spray de aerosol de aluminio sobre la herida para evitar el conejo después de interferir con las suturas.
    7. Recovery. Cease anestesia y observar de cerca la recuperación de la respiración. El conejo se encuentra a continuación, como se describió anteriormente con acceso a comida y agua ad libitum y se observaron diariamente.

2. Realización de Ecocardiografía Fetal y Ecografía Doppler de onda pulsada

  1. El mismo conejo se transfiere luego a GA 30 días para ecocardiográficas y evaluación de ultrasonido. El conejo se coloca sobre una almohadilla de calentamiento durante la duración de la exploración.
  2. Procedimiento Anestesia.
    1. Inducción de la anestesia se consigue mediante la administración de ketamina 35 mg / kg (Ceva Santé Animale, Bruselas, Bélgica) y xilazina 5 mg / kg (Ceva Santé Animale, Bruselas, Bélgica) por vía intramuscular. Una vez sedado, obtener acceso intravenoso utilizando una cánula de calibre 24 (BD Insyte-W, Becton Dickinson Infusion Therapy Systems, Utah, EE.UU.) se inserta en una vena auricular periférico.
    2. Mantener la anestesia con una infusión continua de ketamina y xilazina: 2 ml de ketamina (100 mg / ml) y 1,5 ml de xilazina (20 mg / ml) a 46,5 ml de solución salina normal, a continuación, infundido a través de una bomba de jeringa a 40 ml / h. Asegure una de tres vías-tap y adjuntar una jeringa de 5 ml de la anestesia rescate: 2 mlketamina (100 mg / ml) y 1,5 ml de xilazina (20 mg / ml). Los bolos de 0,5 ml de anestesia rescate rara vez se requieren. Administrar buprenorfina analgésica 0,03 mg / kg (Temgesic; Schering-Plough) subcutaneouslyprior a la cirugía. El oxígeno 2 L / min se aplica por la máscara. Coloque un oxímetro de pulso (Nellcor N-20, Covidien, Irlanda) en el segundo y tercer dedo del pie materna para monitorear continuamente la frecuencia cardíaca y la saturación arterial de O 2.
  3. Laparotomía abdominal y exteriorización uterina. Consulte 1.3.3 y 1.3.4.
  4. Posición fetal para ecocardiografía y ecografía.
    1. Coloque el conejo en una posición lateral que mira hacia el investigador. Esto facilita la fácil recuperación de un solo saco gestacional por examen y evita la tracción excesiva sobre los vasos uteroplacental. En lo posible, trate de exteriorizar un solo saco gestacional a la vez para minimizar la exposición. Asegúrese de que el saco gestacional expuesta se coloca en una gasa de regadío concalentado solución salina. Para asegurar resultados estandarizados entre los diferentes grupos de estudio, por lo general sólo el feto en el ovario y termina vaginales de cada cuerno uterino se utilizan en el examen de ultrasonido.
    2. La función cardíaca fetal es muy susceptible al efecto de la exteriorización uterina, cambio en la temperatura y la presión desde el transductor de ultrasonidos a través de los vasos de la placenta. Para minimizar estos efectos de confusión ambientales y iatrogénica sobre la función cardíaca, el examen de ultrasonido debe comenzar inmediatamente después de la exteriorización del saco gestacional y debe ser sistemática y eficiente. En nuestra experiencia, los cambios en la función cardíaca fetal rara vez ocurren en los primeros 5 minutos de exposición. Si se produce bradicardia fetal, retire la sonda de ultrasonido, cambiar la posición del feto para evitar torceduras de los vasos fetoplacentaria, irrigar con suero calentado o volver brevemente el saco gestacional dentro del abdomen materno. Si la bradicardia fetal es persistente, el examen de esta feTus debe ser abandonada a favor de examinar el siguiente feto.
  5. La ecocardiografía fetal.
    1. Se requiere que el Visualsonics VEVO 2100 (Toronto, Canadá) plataforma microultrasound de alta resolución con el software de análisis cardiaca y la tensión instalada. Un VisualSonics MS-250 transductor (VisualSonics, Toronto, Canadá) se utiliza para la adquisición de datos. Esto tiene una frecuencia central de 21 MHz con un ancho de banda de 13-24 MHz. El enfoque geométrico es de 15 mm, el ancho máximo de la imagen es de 23 mm y la profundidad máxima de la imagen es de 30 mm. La huella es de 28 x 5,75 mm. Los datos se obtienen de acuerdo con la Sociedad Americana de Ecocardiografía directrices y normas para la ejecución del ecocardiograma fetal. 20
    2. La adquisición de datos 1: vista lateral a nivel de la cámara de cuatro-vista lateral, grabar un modo B Película continua de al menos cinco ciclos cardiacos para determinar la tensión, la velocidad de deformación, velocidad y desplazamiento.. Esto se analiza fuera de línea utilizando el VevoStrain(Visualsonics, Toronto, Canadá) el algoritmo que se describió anteriormente en la revista en detalle. 21 índices ecocardiografía en modo M se puede obtener en esta vista estándar. Desconectado mediciones de la estructura y la función cardíaca se pueden analizar: ventricular interno y diámetros del septo en sístole y diástole, el volumen, el volumen sistólico, la fracción de acortamiento, fracción de eyección y el gasto cardíaco 21.
    3. La adquisición de datos 2:. Vista apical En el nivel de los cuatro-cámara-vista, bucle de cine en modo B apical se puede repetir para VevoStrain análisis como se describe anteriormente. Ecocardiografía en modo M se utiliza para evaluar tricúspide (TAPSE) y excursiones mitral anular plana sistólica (MAPSE) y la tensión longitudinal y la velocidad de deformación. 22,23 Esta visión apical también permite evaluar valvular flujo de ondas de velocidad y el índice de rendimiento miocárdico modificado como antes describen. 24
  6. Fetoplacentaria pulso-Doppler saludó ultrasound.

Formas de onda de la velocidad de flujo (FVW) de la arteria umbilical se obtienen mediante la localización de los vasos umbilicales utilizando Doppler color y luego la colocación de la puerta de muestra del Doppler pulsado sobre la arteria umbilical en un bucle libre de cordón umbilical. 25 La arteria cerebral media (MCA) es FVW situado mediante la colocación de la puerta de muestra del Doppler pulsado justo más allá del origen de la MCA una vez que el círculo de Willis se encuentra por Doppler color. 26 El ductus venoso (DV) FVW se obtiene mediante la colocación de la puerta de muestra del Doppler pulsado en la parte proximal de la DV visto con Doppler color donde se origina a partir de la vena umbilical intrahepática, ya sea en una vista sagital o transversal del feto. 26 El índice de pulsatilidad (PI) se calcula fuera de línea utilizando el software de análisis cardiovascular VisualSonics.

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Resultados

Un crecimiento asimétrico restringido el feto y la placenta de la ligadura vascular uteroplacentario se compara con un control normal feto y la placenta en la Figura 1F. Crecimiento asimétrico se confirma por la reducción de peso al nacer neonatal y el aumento de la circunferencia de la cabeza: relación de la circunferencia abdominal con los controles. Los resultados representativos de los estudios Doppler fetoplacentaria se muestran en la Figura 2. Se muestra un patrón de baja resisten...

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Discusión

Hemos utilizado un enfoque validado previamente de reducir quirúrgicamente el flujo sanguíneo útero-placentario en un conejo para producir retraso del crecimiento intrauterino 13-16 y más tarde el examen de la función cardíaca fetal 14 para describir la tecnología microultrasound y el análisis de la función cardiaca disponibles en el VisualSonics VEVO 2100. La capacidad para reproducir fetoplacentaria Doppler cambios de fetos con CIR humanos en un modelo de pequeños animales y para permitir a conti...

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Divulgaciones

El autor Profesor Jan D'hooge tiene un acuerdo de investigación con VisualSonics. El resto de autores no tener ningún conflicto.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por un NHMRC Beca Hamilton-Fairley (RH, AL), Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno de Victoria (RH, EW) y el Marie Curie Industria-Academia de colaboración y Caminos conceder el patrocinio de la Comisión Europea (ME, PD) . Los autores desean agradecer al Dr. Andre Miyague, Dr. Francesca Russo, la Sra. Rosita Kinnart y el Sr. Ivan Laermans por su experiencia técnica en la producción de este video.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
KetaminaCeva Sante Animalehttp://www.ceva.com/en
XylazineCeva Sante Animalehttp://www.ceva.com/en
Depot ProveraPharmacia Upjohn
Penicilina GKela Pharmahttp://www.kela.be
LidocaineB Braun Medicalhttp://www.bbraun.com/
TemgesicSchering-Ploughhttp://www.merck-animal-health-usa.com/
IsoluraneIsoba Vet; Abbott Laboratories Ltdhttp://www.abbottanimalhealth.com/index.html
EthiconJohnson and Johnsonhttp://www.ethiconproducts.co.uk/products/sutures
EthiconJohnson and Johnsonhttp://www.ethiconproducts.co.uk/products/sutures
EthiconJohnson and Johnsonhttp://www.ethiconproducts.co.uk/products/sutures
VEVO 2100VisualSonicsSN100-0032http://www.visualsonics.com/
Aquasonic GelParker Laboratories01 02http://www.parkerlabs.com/ultrasound_products.html
Nellcor N-20PA Oxímetro de pulsoCovidienhttp://www.nellcor.com/prod/PRODUCT. ¿ASPX? S1=POX& S2=LUN& id=282& V

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