Artículo de método

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

DOI:

10.3791/50404

⸱

18 de julio de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Génétique, Papillomavirus et Cancer Humain (GPCH), Institut Pasteur , 2Cellule Pasteur, Université Sorbonne Paris Cité, 3Center for Cancer Systems Biology (CCSB), Harvard Medical School, Department of Cancer Biology, Dana Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.

Resumen

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Esfuerzos importantes se reunieron para generar mapas de la red de interacción proteína-proteína a gran escala completa. Esto es fundamental para entender las relaciones patógeno-huésped y se realizó esencialmente mediante cribados genéticos en sistemas de levadura de dos híbridos. La reciente mejora de la detección de la interacción proteína-proteína mediante un ensayo de complementación de fragmento de luciferasa basado en Gaussia ahora ofrece la oportunidad de desarrollar enfoques integradores interactomic comparativos necesarios para comparar rigurosamente perfiles de interacción de proteínas a partir de diferentes variantes de cepas de patógenos contra un conjunto común de factores celulares.

Este documento se centra específicamente en la utilidad de la combinación de dos métodos ortogonales para generar proteína-proteína interacción bases de datos: la levadura de dos híbridos (Y2H) y un nuevo ensayo, de alto rendimiento ensayo de complementación proteica princeps Gaussia (HT-GPCA) realizado en células de mamífero. nt "> Una identificación a gran escala de socios celulares de una proteína de patógeno se realiza en el apareamiento basado en proyecciones levadura de dos híbridos de bibliotecas de ADNc utilizando múltiples variantes de cepas de patógenos. Un subconjunto de socios que interactúan seleccionados en una puntuación alta confianza estadística es aún más validado en células de mamíferos para interacciones por pares con todo el conjunto de variantes de proteínas de patógenos utilizando HT-GPCA. Esta combinación de dos métodos complementarios mejora la robustez del conjunto de datos de interacción, y permite la realización de un análisis de la interacción comparativa estrictas. Tales interactómica comparativos constituye una estrategia fiable y potente para descifrar cualquier interplays patógeno-hospedador.

Introducción

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La creciente cantidad de datos recogidos para generar mapas de interacción proteína-proteína abre perspectivas para entender mejor las infecciones por patógenos. Como comprensión global de las infecciones de patógenos comienza a emerger, que proporciona acceso a la gama de las perturbaciones inducidas por las proteínas de patógenos cuando se conecta el proteoma humano 1. Es de este modo ofrece una manera de comprender cómo patógenos manipulan la maquinaria de la célula huésped. En particular, la asignación de varias redes de interacción virus-huésped reveló que las proteínas virales se dirigen preferentemente proteínas del huésped que son altamente conectados en la red celular (hubs), o que son fundamentales para muchos caminos en una red (proteínas cuellos de botella) 2-4. Estas interacciones permiten que los virus para manipular los procesos celulares importantes, que es fundamental para replicar y producir una progenie infecciosa. Mapeo de interacciones comparativo se llevó a cabo recientemente sobre los virus relacionados con el objetivo de extraer información relativa apatogénesis 4. Por otra parte, los estudios de la interacción huésped-patógeno paisaje se han extendido a muchos patógenos 5. La identificación de factores de células objetivo proporciona información detallada sobre las estrategias utilizadas por los patógenos de infectar las células y permite la detección de posibles marcadores patógenos.

La levadura de dos sistema híbrido es el método más popular para identificar las interacciones binarias desde la detección genética es una herramienta eficaz y sensible para la cartografía de alto rendimiento de las interacciones proteína-proteína. El enfoque que aquí se propone mejora aún más proyecciones Y2H individuales mediante la evaluación de una proteína de múltiples variantes de cepas patógenos, proporcionando así acceso a una visión comparativa de patógeno-huésped interacciones proteína-proteína. Por otra parte, una limitación importante de la levadura de dos híbridos se encuentra en una alta tasa de falsos negativos, ya que se recupera aproximadamente el 20% de las interacciones totales 6. Esto implica que las interacciones detectadas con sólo un subconjunto de patogens variantes podrían haber escapado a la detección con los otros. Por lo tanto, los socios individuales emergentes de todas las pruebas de detección de dos híbridos se enfrentan al reto aún más para la interacción con la gama completa de cepas estudiadas, proporcionando interacción de datos comparativos. Desde que se demostró que la combinación de diferentes metodologías aumenta fuertemente la solidez de la interacción proteína-proteína conjuntos de datos 7, esta validación se lleva a cabo en células de mamífero por un ensayo de complementación de proteínas-fragmento recién desarrollada llamada HT-GPCA 8. Este sistema basado en células permite la detección de interacciones de proteínas mediante la complementación de la luciferasa Gaussia princeps dividida y ha sido diseñado para ser compatible con un formato de alto rendimiento. Gracias a su tecnología de luminiscencia con sede y su bajo nivel de ruido de fondo en comparación con otro ensayo basado en la fluorescencia, HT-GPCA muestra sorprendentemente alta sensibilidad.

En general, este enfoque constituye un eficienteherramienta para generar un mapeo exhaustivo de interplays huésped-patógeno, lo que representa el primer paso hacia una comprensión global de los secuestros célula huésped.

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Protocolo

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1. Levadura de dos híbridos Screenings

  1. Haga las siguientes soluciones requeridas:
    1. Fuera de la gota sintético completo (SD): se disuelven 26,7 g de base mínima SD con glucosa en 1 L de agua. Añadir 2 g de mezcla de aminoácidos preparada como sigue: 2 g de hemisulfato de adenina, 2 g Arginina HCl, HCl 2 g Histidina, Isoleucina 2 g, 4 g Leucina, Lisina HCl 2 g, 2 g Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g de L -serina, 2 g de L-Treonina, Triptófano 3 g, 2 g de tirosina, 1,2 g de uracilo, 9 g Valina.
    2. Gota selectivo Salida SD-L/-W/-H: SD que contiene cada aminoácidos esenciales, excepto los especificados (-L-leucina,-W:-triptófano;-H:-histidina).
    3. YPGLU: Por 1 L, peso 10 g de extracto de levadura, 10 g de Bacto peptona y 20 g de glucosa. Completo con 25 g Bacto agar de medio sólido.
    4. YCM: Igual que YPGLU, pero el pH se ajustó a 4,5.
  2. El apareamiento y la difusión
    1. Use alícuotas congeladas de pre-transformed cepa de levadura Y187 (tipo de apareamiento α) que contiene una biblioteca de ADNc clonado en pACT2. Comprobar la viabilidad celular en placas diluciones seriadas en placas SD-L.
    2. Clonar la ORF patógeno en pGBKT7 vector, y transformar el plásmido recombinante utilizando un procedimiento estándar en la cepa de levadura AH109 (un tipo de apareamiento).
    3. Spread pGBKT7-transformó AH109 levaduras en placas SD-W. Incubar al menos dos días 30 ° C en un incubador humidificado. Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta que el cribado de dos híbridos.
    4. Use 3-aminotriazol (3-AT), un inhibidor competitivo de la enzima HIS3, para contrarrestar el potencial de auto-transactivación del gen informador HIS3 por las proteínas de los agentes patógenos. Realizar una prueba de la activación automática mediante la determinación de la concentración de 3-AT, lo que impide el crecimiento de la levadura pGBKT7-transformado en placas SD-W/-H.
    5. Seed 30 ml de SD-W con pocas colonias de pGBKT7 transformada AH109. Incubar 30 horas a 30 ° C con rotación.
    6. Seed 200 ml de SD-W con el 30 mlAH109 de las culturas. Incubar con rotación alrededor de 20 horas a 30 ° C.
    7. Incubar descongelado biblioteca de ADNc-Y187 transformada en 20 ml YPGLU, incubar 10 min a 30 ° C con rotación.
    8. Centrifugar un volumen de pGBKT7-transformado AH109 cultura correspondiente a una cantidad equivalente de células viables de levadura Y187 durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante y se resuspende el precipitado en 10 ml YPGLU.
    9. Mezclar la levadura AH109 resuspendido con Y187 biblioteca que contiene. La transferencia en un tubo de 50 ml. Se centrifuga durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C, retirar cuidadosamente el sobrenadante (frágil sedimento).
    10. Resuspender el pellet en YPGLU conseguir un total de 1,5 ml.
    11. Levadura Spread a 3 YCM-agar placas de 150 mm, 0,5 ml / placa. Incubar 4,5 horas a 30 ° C.
    12. Recoger levadura acoplado de placas YCM por raspado con un vaso en el rastrillo de 10 ml de SD-L/-W/-H. Lavar las placas dos veces con 5 ml de medio de SD-L/-W/-H y piscina.
    13. Centrifugar 5 min a 3500 rpm, 20° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de levadura en 5 ml de medio SD-L/-W/-H.
    14. Extienda la levadura acoplado a 10 placas (0,5 ml / placa) de Agar SD-L/-W/-H complementado con la concentración adecuada de 3-aminotriazol (3-AT) obtenido en la prueba de activación automática. Incubar a 30 ° C en un ambiente humidificado durante 6-10 días.
    15. Determinar la tasa de diploide (2n) con el fin de evaluar la eficiencia de acoplamiento mediante la difusión de 250 l de diluciones en serie (10 -4 a 10 -6) de la suspensión de levadura se aparearon en placas SD-L/-W. Incubar las placas a 30 ° C durante dos días. Recuento de las colonias cultivadas en SD-L/-W, y deducir el número total diploide presente en el volumen inicial de la levadura acoplado. Señalar este número diploide de levadura número biblioteca que contiene viable para calcular la tasa de diploide. Se debe oscilar alrededor de 10-25%.
    16. 6-10 días después de la incubación a 30 ° C, recoger las colonias de levadura se aparearon en SD-L/-W/-H fresca + 3-AT placas. [Sugerencia: Para la levadura en un esquema de 8carriles de 12 pozos que reproducen una placa de 96 pocillos de manera que será más fácil después para la secuenciación]. Deje colonias de levaduras crecen durante 4-5 días a 30 ° C en un ambiente humidificado.
  3. La detección de his3 clones positivos por PCR y secuenciación
    El objetivo es para amplificar por PCR la ORF contenida en los pACT2 vectores de colonias de levaduras cultivadas en placas de SD-L/-H/-W selectivos.
    1. Coloque una placa de PCR 96 en el hielo.
    2. Para lisar las células de levadura, añadir 50 l por pocillo de una solución 20T zimolasa (2,5 mg / ml en 10 mM de tampón HEPES de pH 7,7).
    3. Resuspender una colonia por pocillo.
    4. Incubar 15 min a 37 ° C y 15 min a 95 ° C.
    5. Ponga la placa posterior en el hielo. Añadir 50 l de agua destilada por pocillo. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
    6. Centrifugar durante 5 min a 3500 rpm y 4 ° C.
    7. 10 l amplificar por PCR para detectar un inserto usando cebadores de recocido ambos lados de la ORF derivados de cDNA en vectores pACT2. El protocolo es gado para la amplificación de 96 colonias de levadura lisadas con el ExTaq polimerasa. Preparar la siguiente mezcla: 525 l 10X tampón ExTaq, 420 l de la mezcla dNTP (2,5 mM), 10,5 l Cebador directo (1 g / l), 10,5 cebador inverso l (1 g / l), 31,5 l ExTaq (5 U / l ) y 3202,5 ​​l H 2 0. Distribuir 40 l de la mezcla por pocillo en una placa de PCR de 96. Añadir 10 l de levadura lisada por pocillo. Realizar la amplificación de la siguiente manera: 94 ° C durante 3 min, luego 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 4 min, y al final con 72 ° C durante 7 min. Ejecutar 3 l de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,2% para detectar los clones positivos por PCR. Tenga en cuenta que el uso de pre-molde 96 también se recomienda geles de agarosa.
      [Sugerencia: placa puede ser almacenado a -20 ° C durante unos meses y volver a utilizar para el nuevo PCR]
    8. Secuencia de los fragmentos de PCR amplificados a partir de aislados HIS3 clones positivos. Realizar un análisis BLAST para identificar celular ORF. Alineaciones de baja confianza (E valor ygt; 10 -10, la identidad <80%, longitud de péptido <20 aminoácidos) se descartan, así como frameshifted y prematuro codón de parada que contiene secuencias.

2. Edificio Matriz para HT-GPCA

HT-GPCA es un ensayo basado en células de mamífero que ambas proteínas de patógenos y de acogida se expresan transitoriamente fusionado con fragmentos complementarios de la división Gaussia princeps luciferasa. Tras la interacción de los socios, esta enzima se reconstituye lo que permite la medida de su actividad enzimática. La intensidad de la interacción es por lo tanto deducir de una Relación de Luminiscencia normalizado (véase más adelante y la Figura 1)

  1. Selección de los socios de células huésped
    1. Seleccione las proteínas que se identifican más de tres veces en los exámenes Y2H para una validación adicional de las células de mamíferos para aumentar la confianza de conjunto de datos 9.
    2. Agregar socios que interactúan conocidas de las proteínas de patógenos como positiVE controles.
  2. Traslado en vectores compatibles HT-GPCA
    1. Clonar cada patógeno proteína ORF en un vector pSPICA-N2 para generar proteínas de patógenos con los aminoácidos 110-185 de la princeps Gaussia humanizados luciferasa fusionado en su extremo N-terminal (GL2-patógeno fusiones de proteínas).
    2. Amplificar por PCR proteína celular ORF directamente a partir de los clones positivos Y2H o desde otros recursos de ORF (ORFeome humano http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) y transferir en vectores pSPICA-N1 para generar proteínas fusionadas en el extremo N-terminal con los 18 aminoácidos a 109 de humanizado Gaussia princeps luciferasa (fusiones de proteínas GL1-huésped).
      [Sugerencia: Para la clonación a gran escala, se recomienda el sistema de clonación Gateway. En ese caso, para la amplificación por PCR, utilizar cebadores diseñados para contener sitios compatibles de puerta de enlace].
    3. Secuencia de todos los vectores de expresión. Las secuencias de la pSPICA-N1 y N2-pSPICAse pueden encontrar en la referencia 8.

Tenga en cuenta que construcciones de plásmidos pueden ser invertidas, es decir, las proteínas de patógenos en pSPICA-N1 y proteínas del huésped en pSPICA-N2.

3. High-Throughput Gaussia princeps luciferasa basado en ensayo de complementación de proteínas (HT-GPCA)

  1. Transfección celular
    1. Seed células 293T en 350.000 células / ml de DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) sin antibióticos. Distribuir 100 l / pocillo en placas de cultivo blancos estériles. No exceder de 10 placas en un solo experimento. Deje que las células crezcan durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO 2.
      [Consejo:. Dado que los plásmidos pSPICA contienen un origen de SV40, el uso de las células 293T permite su replicación en las células transfectadas y por lo tanto conduce a la sobreexpresión de los dos fragmentos de luciferasa]
    2. El día siguiente, las células transfectar utilizando cualquier protocolo de transfección adecuado. Tenga en cuenta que para ciertos reactivos de transfección, la number de células sembradas puede tener que ser adaptada. Use 100 ng por pocillo de tanto el patógeno y anfitrión ORF construcciones de plásmidos. Co-transfectar 10 ng por pocillo de una de CMV-Firefly plásmido para normalizar la eficiencia de transfección de luciferasa. Cada punto se analizó por triplicado.
      [Consejo:. Mezclas de ADN se pueden realizar el día antes de la transfección y se almacenaron a -20 ° C con juntas adhesivas]
    3. Transferir la mezcla de transfección a las placas de las células 293T cultivadas. Tenga cuidado para depositar suavemente la mezcla de ADN en las células, como 293T no son fuertemente adherente y se desprenden fácilmente de la parte inferior del pozo. Incubar en una incubadora de cultivo celular durante 24-30 horas a 37 ° C con 5% de CO 2.
  1. La lisis celular y la dosis luciferasa Gaussia
    1. Lavar las células con PBS (100 l / pocillo). Añadir 40 l de tampón de lisis 1X de Renilla. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente con agitación.
    2. Ahorra 10 l de lisados ​​celulares en otra plataforma blancade correo para su posterior dosificación de la actividad luciferasa de luciérnaga. Almacenar a 4 ° C o, alternativamente, a -20 ° C con sellado.
    3. Medir la actividad Gaussia en los restantes 30μl de lisados ​​de células mediante la adición de 100 l de reactivo de ensayo de luciferasa de Renilla y contando luminiscencia durante 10 s con un luminómetro. Dosis de una placa de 96 tarda aproximadamente media hora. Realizar la medición con extractos de células frescas ya que el almacenamiento de congelación o largo plazo puede afectar la actividad Gaussia interacción mediada.
  1. Medición de la actividad Firefly
    1. Medir la actividad de luciérnaga en el salvado 10 l de lisados ​​de células mediante la adición de 50 l de reactivo de ensayo de luciferasa de luciérnaga y el recuento de luminiscencia durante 10 s. Dosis de una placa de 96 tarda aproximadamente media hora. [Consejo: La dosis de luciferasa de luciérnaga se puede realizar al día siguiente en lisados ​​congelados.]
  1. Cálculos NLR
    1. Para cada interacción, calcular la relación entre la actividad luciferasa Gaussia y la actividad de luciferasa de luciérnaga para obtener un valor de luminiscencia Gaussia normalizado teniendo en cuenta la eficiencia de transfección y la viabilidad celular. Calcular la media de los triplicados.
    2. Para supervisar la interacción, estimar un Ratio Normalizada luminiscencia (NLR) para cada par patógeno-huésped. Para ello, se divide la actividad de luminiscencia Gaussia normalizada detectada en presencia de ambos patógenos y proteínas del huésped por la suma de las actividades medidas en los pocillos de control (Figura 1 adaptada de la referencia 8). El NLR valor de corte para las interacciones positivas ha sido estimada en alrededor de 3,5 8.
  1. Análisis de los datos
    1. Realizar agrupación jerárquica utilizando el paquete estadístico R. En primer lugar, agrupar los datos NLR en categorías, y luego calcular un dendrograma interacción utilizando el método de ligamiento completo. Visualice estedendrograma con JavaTreeView 10. Calcular la distancia entre la interacción dendrograma y el árbol filogenético utilizando un coeficiente de correlación de Pearson.
    2. Para generar redes de interacción, seleccione las interacciones positivas del conjunto de datos HT-GPCA y utilizar el software Cytoscape 1. Extraer los grados de las proteínas del huésped y trazar su distribución para acceder a la dinámica local de la red. Redes Huésped-patógeno se pueden superponer a la interactome anfitrión para proporcionar una evaluación del impacto global de las proteínas de patógenos en la red celular del huésped.
    3. Extraiga el GO (Gene Ontología) términos relacionados con los factores celulares específicos con la base de datos de bioinformática DAVID 12 para evaluar el enriquecimiento funcional del conjunto de datos.

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Resultados

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Una de las principales de HT-GPCA radica en su alta sensibilidad, como lo demuestra la evaluación de las tasas de falsos positivos y falsos negativos para la proteína E2 del VPH en la Figura 2 (adaptado de la referencia 13). Para determinar la tasa de falsos negativos, interacciones conocidas de E2 de HPV16 fueron evaluados por HT-GPCA (Figura 2A). Cuatro de cada 18 interacciones no fueron recuperados (que corresponde a una tasa de falsos negativos del 22%). Las interacciones positivas ...

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Discusión

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Independientemente, la levadura y dos ensayos de interacción de híbridos y de mamíferos, tales como GST pull-down, o LUMIER Mappit, han demostrado ser instrumentos eficaces para la detección de interacciones proteína-proteína, pero se ven limitados por la alta tasa de falsos positivos y falsos negativos interacciones asociadas con estas técnicas 15. Por otra parte, crece la evidencia de que la combinación de métodos ortogonales aumenta la fiabilidad de la interacción obtenido conjunto de datos 7. E...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta obra fue financiada en parte con fondos del Institut Pasteur y por subvenciones de la Ligue nationale contre le Cancer (subvenciones R05/75-129 y RS07/75-75), la Association pour la Recherche sur le Cancer (becas ARC A09 / 1/5031 y 4867) y la Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 y 026 01 ANR09 MIEN). MM fue un beneficiario de una beca MENRT.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cepas de levaduraClontech
Base mínima SDUS biológicoD9500
AminoácidosSigma
3-amino-1,2,4-Triazol (3-AT)Acros organics264571000
ZymolaseSeikagaku120491
DMEMGibco-Life Technologies31966
Suero fetal bovinoBioWestS1810
Tampón de fosfato solución salina (PBS)Gibco-Life Technologies14190
Penicilina-EstreptomicinaGibco-Life Technologies15140
Tripsina-EDTAGibco-Life Technologies25300
Renilla luciferasa ensayoPromegaE2820
Blanco placade cultivo Greiner Bio-One655083
placas de PCR de 96 pocillos4titude 4t-i0730/C
Incubadora (30 ° C)Memmert
(37 ° C)Luminómetro Heraeus
BertholdCentro XS-LB 960
Incubadora

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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