El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo animal In vivo De imágenes para realizar análisis de tiempo-curso de los recién nacidos infectados con un virus de la luciferasa recombinante.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
En este artículo
Resumen
Resumen
El citomegalovirus humano (HCMV o HHV-5) es un patógeno potencialmente mortal en los individuos inmunocomprometidos. Tras la infección congénita o neonatal, el virus puede infectar y replicarse en el cerebro en desarrollo, lo que puede inducir daño neurológico grave, incluyendo sordera y retraso mental. A pesar de la posible gravedad de los síntomas, las opciones terapéuticas son limitadas por la falta de disponibilidad de una vacuna y la ausencia de una terapia antiviral específica. Además, una descripción precisa de los eventos moleculares que ocurren durante la infección del sistema nervioso central (SNC) está todavía ausente desde observaciones sobre todo se derivan de la autopsia de los niños infectados. Varios modelos animales, tales como macacos rhesus por CMV, se han desarrollado y proporcionado importantes conocimientos sobre patogénesis CMV en el SNC. Sin embargo, a pesar de su proximidad evolutiva con los seres humanos, este modelo estaba limitada por el procedimiento de inoculación intracraneal utilizado para infectar a los animales y los contrasistently inducir la infección del SNC. Por otra parte, las consideraciones éticas han promovido el desarrollo de modelos alternativos, entre los que la infección neonatal de ratones recién nacidos con citomegalovirus ratón (MCMV) ha llevado recientemente a avances significativos. Por ejemplo, se informó de que la inyección intraperitoneal de MCMV a Balb / c recién nacidos conduce a la infección de las neuronas y las células gliales en áreas específicas del cerebro. Estos resultados sugirieron que la inoculación experimental de ratones podría recapitular los déficits inducidos por la infección por HCMV en los niños. Sin embargo, un análisis dinámico de la infección por MCMV de los recién nacidos es difícil de realizar porque la metodología clásica requiere el sacrificio de un número significativo de los animales en diferentes puntos de tiempo para analizar la carga viral y / o parámetros relacionados con la inmunidad. Para sortear este obstáculo y permitir que las futuras investigaciones de los animales mutantes raros, se aplicó en la tecnología de imágenes in vivo para realizar un análisis de tiempo-curso de la viral difusión en el cerebro después de la inyección periférica de un MCMV recombinante que expresa luciferasa a C57Bl / 6 recién nacidos.
Introducción
Citomegalovirus Humano (HCMV/HHV-5) es un miembro de la familia β-herpesvirus. HCMV es un patógeno oportunista muy frecuente que por lo general se adquiere durante la vida temprana como una infección asintomática 1. Como todos los herpesvirus, HCMV persiste durante toda la vida del huésped cuyo sistema inmune controla estrechamente la replicación viral. Los episodios de reactivación viral ocurren principalmente en individuos inmunodeprimidos como los pacientes trasplantados que reciben medicamentos para evitar el rechazo del injerto 2. En los adultos, HCMV también se ha relacionado con los glioblastomas 3. Además, HCMV es un patógeno ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de la suspensión viral
- Obtener la cepa Smith de MCMV expresar luciferasa (Luc MCMV-15) desde el laboratorio de Ulrich Koszninowski. En este recombinante, el gen de la luciferasa se inserta en el locus del genoma IE2 MCMV.
- Para amplificar MCMV-Luc, infectar una línea celular estromal de médula ósea murina (M2-10B4, ATCC n º CRL-1972) con MCMV a diferente multiplicidad de infección (MOI, 0,001 a 1) 16. Para ello, añadir el virus a las células cultivadas en medio libre de suero a 37 ° C. Después de una hora, retirar el sobrenadante y reemplazarlo con DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Un experimento representativo se ilustra en la Figura 1. Tras la inyección intraperitoneal de 50 PFU de MCMV-Luc (panel A muestra una inyección similar realizado con azul de metileno para visualizar la ruta subcutánea de la aguja), los recién nacidos se anestesiaron y se reciben simultáneamente 0,3 mg del sustrato de luciferasa (luciferina, Pinza). Quince minutos más tarde, los animales fueron colocados lado ventral hacia arriba en la cámara de adquisición de la IVIS 50 (En Sistema de imágenes in vivo, .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Gracias al uso de la tecnología de imágenes in vivo para monitorear difusión MCMV-Luc en ratones recién nacidos, hemos sido capaces de observar la propagación viral en el cerebro de los animales mutantes, a diferencia de tipo salvaje. Además la disección del animal y de formación de imágenes ex vivo del cerebro confirmó la presencia del virus luminiscente en el sistema nervioso central. Además, también se realizó la inmunohistoquímica (no se muestra) en secciones delgadas del cerebro con un an.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.
Declaración de Ética
Los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos en las instalaciones de cuidado de los animales del Institut d'Immunologie et d'Hématologie. Manejo de los ratones y los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con la Ley Francesa de Protección de los Animales de Laboratorio. El procedimiento fue aprobado por el servicio veterinario de la Préfecture du Bas-Rhin (Francia) con el número de autorización A-67-345.
Agradecimientos
Damos las gracias a Lee Tuddenham (IBMC, Estrasburgo) para amplificar y titulación MCMV-Luc y Thomas Baumert (INSERM U748, Estrasburgo) por el permiso para usar el animalario del Instituto de Virología. El apoyo financiero del INSERM, Universidad de Estrasburgo y la Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) se reconoce. También se reconoce la participación inicial de Sonia Beroud y Laetitia Lelieur durante su proyecto principal.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Azul de metileno | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Agujas de insulina | VWR | 613-4897 | |
| Ketamina | CentraVet | Ket 201 | |
| Xilacina/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferina Calibrador | 760504 | ||
| gentamicina | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicilina/estreptomicina | Gibco | 15070 | |
| carboximetilcelulosa | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehído | Sigma Aldrich | F8775 | |
| violeta cristal | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Referencias
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cy....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
