El uso de<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

Resumen

El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo animal In vivo De imágenes para realizar análisis de tiempo-curso de los recién nacidos infectados con un virus de la luciferasa recombinante.

Resumen

El citomegalovirus humano (HCMV o HHV-5) es un patógeno potencialmente mortal en los individuos inmunocomprometidos. Tras la infección congénita o neonatal, el virus puede infectar y replicarse en el cerebro en desarrollo, lo que puede inducir daño neurológico grave, incluyendo sordera y retraso mental. A pesar de la posible gravedad de los síntomas, las opciones terapéuticas son limitadas por la falta de disponibilidad de una vacuna y la ausencia de una terapia antiviral específica. Además, una descripción precisa de los eventos moleculares que ocurren durante la infección del sistema nervioso central (SNC) está todavía ausente desde observaciones sobre todo se derivan de la autopsia de los niños infectados. Varios modelos animales, tales como macacos rhesus por CMV, se han desarrollado y proporcionado importantes conocimientos sobre patogénesis CMV en el SNC. Sin embargo, a pesar de su proximidad evolutiva con los seres humanos, este modelo estaba limitada por el procedimiento de inoculación intracraneal utilizado para infectar a los animales y los contrasistently inducir la infección del SNC. Por otra parte, las consideraciones éticas han promovido el desarrollo de modelos alternativos, entre los que la infección neonatal de ratones recién nacidos con citomegalovirus ratón (MCMV) ha llevado recientemente a avances significativos. Por ejemplo, se informó de que la inyección intraperitoneal de MCMV a Balb / c recién nacidos conduce a la infección de las neuronas y las células gliales en áreas específicas del cerebro. Estos resultados sugirieron que la inoculación experimental de ratones podría recapitular los déficits inducidos por la infección por HCMV en los niños. Sin embargo, un análisis dinámico de la infección por MCMV de los recién nacidos es difícil de realizar porque la metodología clásica requiere el sacrificio de un número significativo de los animales en diferentes puntos de tiempo para analizar la carga viral y / o parámetros relacionados con la inmunidad. Para sortear este obstáculo y permitir que las futuras investigaciones de los animales mutantes raros, se aplicó en la tecnología de imágenes in vivo para realizar un análisis de tiempo-curso de la viral difusión en el cerebro después de la inyección periférica de un MCMV recombinante que expresa luciferasa a C57Bl / 6 recién nacidos.

Introducción

Citomegalovirus Humano (HCMV/HHV-5) es un miembro de la familia β-herpesvirus. HCMV es un patógeno oportunista muy frecuente que por lo general se adquiere durante la vida temprana como una infección asintomática ^1. Como todos los herpesvirus, HCMV persiste durante toda la vida del huésped cuyo sistema inmune controla estrechamente la replicación viral. Los episodios de reactivación viral ocurren principalmente en individuos inmunodeprimidos como los pacientes trasplantados que reciben medicamentos para evitar el rechazo del injerto ^2. En los adultos, HCMV también se ha relacionado con los glioblastomas ^3. Además, HCMV es un patógeno importante para los recién nacidos con la inmunidad inmadura ^4-6. La infección primaria en el feto o el neonato en desarrollo puede tener consecuencias graves. Infección por citomegalovirus es la causa infecciosa más común de defectos congénitos y trastornos de la infancia en los países desarrollados. Se estima que la incidencia de infección neonatal HCMV afecta 0,5-1% de Of todos los nacidos vivos entre los cuales 10.5% sufrirá síntomas graves, como microcefalia o hipoplasia cerebelosa. Además, el 10% de los niños infectados con una infección viral subclínica después dará secuelas que conduce al retraso mental, pérdida, defectos visuales o convulsiones y epilepsia ^7,8 audición.

A diferencia de otros herpesvirus humanos tales como herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) que pueden ser inoculados a ratones a través de diferentes rutas de inyección ^9, la replicación de citomegalovirus es específico de la especie. Investigaciones de la patogénesis HCMV que se realizan en diferentes modelos animales Esta característica ha obstaculizado seriamente (ratón, rata, cobaya, mono rhesus) y sus respectivos vehículos comerciales genuinos específicos del host. Todos los vehículos comerciales exhiben similitudes significativas en el tamaño del genoma y la organización, tropismo tisular y la regulación de la expresión génica. También inducen patologías similares en sus respectivos anfitrión. A pesar de la diversidad genómica serentre HCMV y citomegalovirus de ratón (MCMV) (50% de los ORFs presentes en el virus humano se identifican en el CMV murino), el modelo de ratón se ha demostrado recientemente que es ventajoso, sobre todo porque las cepas mutantes pueden ser probados por su capacidad para controlar viral la replicación in vivo. Esto ha llevado a una pantalla genética que permitió una estimación del número de genes de ratón expresadas en la etapa adulta que componen el "resistome" a este virus ^10. En conjunto, esto indica que los ratones MCMV infectados representan un modelo atractivo para el estudio de las interacciones huésped-virus en adultos. La exploración de la infección congénita por CMV es más compleja debido a las diferencias en la organización capa placentaria entre humanos y ratones afectan la transmisión de la madre al feto de la infección viral en ratones. Recientemente, la inyección directa de MCMV en la placenta en el día 12,5 de gestación ha permitido infección del cerebro de ratones recién nacidos que han llevado a un deterioro de audición ^11. Sin embargo, la mayoría investigations ahora utilizan la inyección intraperitoneal de 4-20 horas de edad, recién nacidos para proporcionar difusión viral sistémica que puede conducir a una infección cerebral hematógena, un modelo que es más relevante que la de una inyección intracraneal. Este protocolo proporcionado importantes conocimientos sobre CMV patogénesis y, más particularmente, se demostró que la infección por MCMV de recién nacidos en los resultados de la replicación viral en las células neuronales y gliales situadas en los focos inflamatorios que están infiltrados con células mononucleares como los macrófagos ^12. Este informe también describe la morfogénesis alterada del cerebelo acompañada con la disminución de la proliferación y la migración de neuronas granulares y la inducción de múltiples genes de interferón-estimuladas. El papel esencial de los linfocitos T CD8 + para el control de MCMV en el sistema nervioso central también fue reportado por el mismo grupo de ^13. Un aspecto importante a considerar cuando se analiza el efecto patológico de un microbio es la dinámica de la infectarde iones. En el caso de MCMV, es particularmente crucial para explorar y cuantificar la progresión de la diseminación viral en el cerebro en desarrollo con el fin de entender y anticipar la magnitud de las lesiones futuras neurobiológicos. Tradicionalmente, la cuantificación de la progresión de una infección requiere el continuo sacrificio de los animales infectados para titular el patógeno en los tejidos, tales como el cerebro, que son de otra manera inaccesibles. Este tipo de protocolo es ahora cuestionada por la mejora necesaria del bienestar de los animales y las 3R (reducir, mejorar, reemplazar) los principios ^14. El uso de tecnologías de formación de imágenes in vivo puede permitir una reducción drástica del número de animales que son necesarios en en experimentos de infección in vivo. Aquí, se presenta y describe un análisis de tiempo-luego de la difusión viral en el cerebro a la inyección intraperitoneal MCMV-Luc a los recién nacidos de ratón. Utilizando los mismos animales, que seguidos y controlados en vivo los sitios de intensa vireplicación RAL durante un período de 2 semanas.

Protocolo

1. Preparación de la suspensión viral

1. Obtener la cepa Smith de MCMV expresar luciferasa (Luc ^MCMV-15) desde el laboratorio de Ulrich Koszninowski. En este recombinante, el gen de la luciferasa se ​​inserta en el locus del genoma IE2 MCMV.
2. Para amplificar MCMV-Luc, infectar una línea celular estromal de médula ósea murina (M2-10B4, ATCC n º CRL-1972) con MCMV a diferente multiplicidad de infección (MOI, 0,001 a 1) ^16. Para ello, añadir el virus a las células cultivadas en medio libre de suero a 37 ° C. Después de una hora, retirar el sobrenadante y reemplazarlo con DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Cinco días más tarde, cosechar el medio de cultivo y las alícuotas se almacenan a -80 ° C hasta su uso posterior.
3. La titulación de la suspensión viral mediante ensayo en placa.
   1. Dividir las células 3T3 (ATCC # CRL-1658) en una placa de 24 pocillos a 40.000 células / pocillo en 1 ml de DMEM suplementado con 10% de FCS que contiene penicilina (200 UI / ml) y steptomycin (200 mg / ml) E incubar 24 horas a 37 ° C.
   2. Preparar diluciones en serie (10 ^-1 a 10 ^-8) de una parte alícuota de la suspensión de MCMV en DMEM e infectar las células diana (3T3) con 200 l de dilución después de la eliminación de medio de cultivo celular. Incubar 1 hora a 37 ° C. Añadir 1 ml de medio superior (DMEM FCS al 3%, 2% (v / v) de gentamicina, 200 UI / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina, 8 g / l de carboximetil celulosa) e incubar durante 5 días a 37 ° C.
   3. Fijar las células mediante la adición de 200 l 10% de formaldehído (formaldehído de dilución con agua se debe realizar en una campana química para evitar inhalaciones tóxicas) a cada pocillo, y la incubación de 6 horas a temperatura ambiente. Retirar el medio de cultivo + fijador con la pipeta y se añade solución de tinción celular 200 l (1% de cristal violeta (w / v) en etanol al 20%). Antes de usar, diluir 1 parte con 9 partes de agua milli-Q. Incubar 2 minutos a temperatura ambiente, lavar la placa 3-4x al sumergirlo en agua, dejar secar y contar el número de las placas con un binocular.
4. Diluir MCMV-Luc en DMEM obtener 50 UFP en 50 l y dejar en hielo hasta su uso posterior. Uso de inóculos virales más altas induce letalidad antes de que los recién nacidos alcanzan 2-3 semanas de edad. En nuestra experiencia, 500 UFP inducir letalidad de cada neonato 5 a 7 días después de la inyección.

2. La inyección de neonatos

1. Cuando recién nacidos (de 4 a 20 ratones horas de edad) están disponibles, manipular la basura y los excrementos de la jaula con los guantes antes de manipular con cuidado a las crías para evitar la contaminación por olores "extranjeros" que insistir en la madre y provocar el rechazo de los cachorros .
2. Realice una inyección intraperitoneal usando una jeringa de insulina (29 g) como se muestra en la Figura 1A. Sostenga el recién nacido con la piel dorsal. Con el lado ventral hacia arriba, introducir la aguja por debajo de la pata delantera y empuje suavemente por vía subcutánea para alcanzar la cavidad peritoneal (un poco bajo el ombligo). Actualmente inyectamos 1% de azul de metileno diluido en DPBS y monitoreamos la supervivencia de practique la técnica antes de realizar las infecciones virales. Desde El azul de metileno es claramente visible durante el proceso de inyección, se recomienda realizar esta inyección "entrenamiento" en primer lugar para garantizar la entrega adecuada de la suspensión viral en la cavidad intraperitoneal.
3. Eliminar las diminutas gotas de sangre que puedan surgir y colocar la parte trasera recién nacido en la jaula.

3. Imágenes in vivo

1. En el día 7, manejar los recién nacidos con la misma precauciones como se mencionó anteriormente. Se inyecta por vía intraperitoneal una mezcla de anestésicos (4 mg / ml de ketamina, 0,8 mg / ml de xilazina) y luciferina (0,15 mg / g de peso corporal) en 50 l en cada animal. El peso promedio corporal de los animales es de 1-2 g, y la dosis de anestésicos por animal es: ketamina 40 mg, 8 mg de xilazina Espere 12 a 15 minutos hasta que la luciferina alcanza su máximo de emisión. Esta tiene que ser determinada de antemano y depende del proveedor de luciferina y el sistema de imagen utilizado.
2. Mientras que los cachorros son anesthetized, etiquetarlas para la futura identificación y cosechar una pequeña muestra de tejido que luego pueden ser utilizados para futuras genotipado si se utilizan animales mutantes.
3. Coloque los cachorros en el sistema de imagen y realizar la adquisición de la luz emitida por todo el cuerpo. Siete días después de la infección, el virus se ha replicado en numerosos ejemplares en los órganos diana como el hígado, los riñones, los pulmones y las glándulas salivales, por lo tanto, la duración de la exposición debe ser corto. En nuestro caso, llevamos a cabo la adquisición de 10 a 20 segundos (Figura 1B). La plataforma en la cámara de adquisición del dispositivo de formación de imágenes tiene que ser calentado para evitar el enfriamiento excesivo de la temperatura del cuerpo de los animales anestesiados. Además, es útil para obtener imágenes de baja resolución de varios animales dentro de una ronda de adquisición y posteriormente, subir en la plataforma cerca de la lente de la cámara con el fin de centrarse en una parte de un animal en particular o un órgano aislado después de la disección. El software debe permitir cambios rápidosde los parámetros (tiempo de exposición, la distancia de la muestra / de la lente, la sensibilidad), la cuantificación de las regiones de interés definidas y futura exportación de imágenes instantáneas.
4. Para adquirir la señal de luz sólo desde la cabeza, cubrir el cuerpo de los recién nacidos se extiende lateralmente con un, papel grueso y oscuro que enmascarar los fotones emitidos a nivel de los órganos en los que se produce una alta replicación viral (hígado, pulmones, glándulas salivales) y realizar adquisición de 5 a 10 min (Figura 1C). Realizar adquisición de el lado opuesto del animal en las mismas condiciones.
5. Reintroducir los cachorros en la jaula y coloque una lámpara de calor en la parte superior para evitar el enfriamiento excesivo de los recién nacidos anestesiados. Monitorear regularmente la recuperación post-anestésica. Con la dosis indicada, la anestesia actualmente dura 30 min.
6. Repita el mismo procedimiento en los días 9, 11 y 14. En los días 11 y 14, cambiar la dosis de anestésicos (6 mg / ml de ketamina, 1,2 mg / ml de xilazina).

Resultados

Un experimento representativo se ilustra en la Figura 1. Tras la inyección intraperitoneal de 50 PFU de MCMV-Luc (panel A muestra una inyección similar realizado con azul de metileno para visualizar la ruta subcutánea de la aguja), los recién nacidos se anestesiaron y se reciben simultáneamente 0,3 mg del sustrato de luciferasa (luciferina, Pinza). Quince minutos más tarde, los animales fueron colocados lado ventral hacia arriba en la cámara de adquisición de la IVIS 50 (En Sistema de imágenes in vivo, ...

Discusión

Gracias al uso de la tecnología de imágenes in vivo para monitorear difusión MCMV-Luc en ratones recién nacidos, hemos sido capaces de observar la propagación viral en el cerebro de los animales mutantes, a diferencia de tipo salvaje. Además la disección del animal y de formación de imágenes ex vivo del cerebro confirmó la presencia del virus luminiscente en el sistema nervioso central. Además, también se realizó la inmunohistoquímica (no se muestra) en secciones delgadas del cerebro con un an...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo/Material
DMEM	Fisher Scientific	W3523A
Azul de metileno	Sigma Aldrich	319112
Agujas de insulina	VWR	613-4897
Ketamina	CentraVet	Ket 201
Xilacina/Vetranal	Sigma Aldrich	46995
DPBS	DUTSCHER	P0436500
Luciferina Calibrador		760504
gentamicina	Sigma Aldrich	G1272
penicilina/estreptomicina	Gibco	15070
carboximetilcelulosa	Sigma Aldrich	C4888
formaldehído	Sigma Aldrich	F8775
violeta cristal	Sigma Aldrich	C3886
Equipment
IVIS 50	Caliper/Perkin Elmer