La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Resumen

A pesar de la importancia clínica y funcional del hipotálamo, En el útero Manipulación genética de su desarrollo rara vez se ha intentado. Te mostramos un procedimiento detallado para En el útero Electroporación en el hipotálamo del ratón y muestran resultados representativos de transfección hipotálamo total y parcial (regional).

Resumen

La modificación genética de regiones específicas del cerebro de los mamíferos es el desarrollo de un enfoque experimental muy potente. Sin embargo, la generación de nuevos mutantes de ratón suele ser lento y frustrante. Se ha demostrado que el acceso al cerebro de ratón en desarrollo en el útero con la supervivencia post-operatoria razonable es posible. Sin embargo, los resultados de este procedimiento se han reportado casi exclusivamente para la parte más superficial y de fácil acceso del cerebro en desarrollo, es decir, la corteza. El tálamo, una región más estrecha y más medial, ha resultado más difícil objetivo. Transfección en los núcleos más profunda, especialmente aquellos del hipotálamo, es quizás los resultados más difíciles y por lo tanto, muy pocos han sido reportados. Aquí se demuestra un procedimiento para orientar todo el neuroepitelio hipotalámica o parte de él (regiones hipotalámicas) para la transfección por medio de electroporación. Las claves de nuestro enfoque ya narcosis tiempos, inyección en el third ventrículo, y amable y la colocación de los electrodos apropiados. Además, mostramos los resultados de la focalización y el posterior análisis histológico del núcleo hipotalámico más rebajada, el cuerpo mamilares.

Introducción

La manipulación genética del cerebro de ratón embrionario es un enfoque preferido para aprender acerca de la regulación del desarrollo. La generación de líneas de ratones mutantes sin embargo, es lento y caro. Un método poderoso para introducir cambios genéticos específicos en el desarrollo de las neuronas del cerebro de mamífero es la electroporación en el útero. Esencialmente, la técnica consiste en transfectar ADN en el neuroepitelio embrionario del cerebro por medio de impulsos eléctricos, a continuación, permitiendo que el embrión para sobrevivir durante un cierto período de tiempo, recoger el cerebro y examinarlas para su posible novela, fenotipos info....

Protocolo

1. Preparación de ADN y vidrio Micropipetas para Inyección

1. Buenas micropipetas de vidrio de calidad son esenciales para reducir la velocidad inicial alta aborto debido a la pérdida de líquido amniótico. El procedimiento para sacar micropipetas de vidrio ha sido bien documentado ^13,18,25. Use 1,2 mm de diámetro capilares tirado en una convencional Sutter P-97 dispositivo con los ajustes P = 500; calor = 300; Tire = 40; Velocidad = 50; Tiempo = 50. Coloque el extractor de 3 mm filamentos "valle" (Sutter Instrument FT330B). Los filamentos de tamaño de 2 mm han dado para nosotros los resultados menos satisfactorios. Por otro lado, biselado de la mic....

Resultados

La mayoría de las neuronas del hipotálamo nacen entre E11.5 a E15.2, según el análisis de nacimiento-dating en la rata ²⁶ traducido en el desarrollo de algo más corta ratón ^27,28. El pico de la neurogénesis hipotálamo se alcanza a E12.5 ^29-31. En consecuencia, a la edad de transfección elegido para el presente estudio (E12.5), una gran proporción de neuronas hipotalámicas puede ser etiquetado en cualquier nivel rostro-caudal dado.

Análisis en E18.5 en seccion.......

Discusión

Acerca de la anestesia: Desde electroporación en el útero en el hipotálamo puede ser técnicamente difícil y requerir tiempos más largos narcosis, preferimos para inducir y mantener la anestesia mediante la administración de una mezcla de oxígeno e isoflurano. En nuestra experiencia, los animales se mantienen adecuadamente anestesiado de esta manera por períodos de hasta una hora por lo menos, la recuperación de la madre es muy rápido, y la supervivencia de los embriones mejorar. Otros enfoques para la anestesia.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			REACTIVOS
Acepromazina	Sanofi GmbH		anestésico
Isoflurano	Baxter	HDG9623	anestésico
Ketamin	Pharma GmbH		anestésico
Fast Green	Fluka	44715
Rimadyl	Pfizer		antiinflamatorio no esteroideo
Braunoderm	Braun	3887138	povidona yodada
Tampón de fosfato solución salina PBS	Gibco	14190
Temgesic (buprenorfina)	Essex Pharma		analgésico opioide
ungüento para los ojos	Pan-Ophtal	7136926
Xilacina	Bayer
			FUERTE
anestesia fuerte Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australia	ACN 004 903 682
Tirador capilar P-97	Sutter Instrument Co.	P-97	y nbsp;
Compresstoma	Precisionary Instr.	VF-300	Dispositivo tipo vibrátomo
Microscopio confocal	Zeiss	LSM700
Criostato	Leica CM3050S
Electroporador	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY21EDIT
Electrodo 1	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY550-10	Electrodo de aguja de acero inoxidable, punta de 10 mm, 0,5 mm de diámetro.
Electrodo 2	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY700P4L	Cubierta Redonda Placa de Platino de 4 mm de diámetro
Fibra óptica fuente de luz fría	Leica	KL2500 LCD
Capilares de vidrio	Aparato Harvard	GC120T-15	1. 2 mm de diámetro exterior x 0. 94 mm de diámetro interno
Esterilizador de perlas de vidrio	Fine Science Tools	FST250
Almohadilla térmica	Harvard Apparatus	py872-5272
Dispositivo de inyección	World Precision Instruments	Pneumatic Pico Pump PV820
Sutura de sutura recubierta de hilo Vicryl	Ethicon	V4914	Sutura de sutura peritoneal
Thr. Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	sutura cutánea