Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Resumen

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Resumen

Se requiere la manipulación de la expresión génica en los tejidos para llevar a cabo estudios funcionales. En este trabajo se demuestra la técnica de microinyección cerebroventricular (CVMI) como un medio para modular la expresión de genes en el cerebro del pez cebra adulto. Mediante el uso de CVMI, las sustancias se pueden administrar en el líquido cerebroventricular y ser distribuidos a fondo a lo largo del eje rostrocaudal del cerebro. En particular nos centramos en el uso de oligonucleótidos antisentido de morfolino, que son herramientas potentes para derribar la expresión génica in vivo. En nuestro método, cuando se aplica, las moléculas de morfolino son absorbidos por las células que recubren la superficie ventricular. Estas células incluyen las células gliales radiales, que actúan como progenitores neurogénicos. Por lo tanto, derribando la expresión génica en las células gliales radiales es de suma importancia para analizar la respuesta generalizada neurogénesis en el pez cebra, y también dar una idea de cómo los vertebrados podrían sostener Neurogen adultosrespuesta nesis. Tal comprensión también ayudaría a los esfuerzos para la aplicación clínica en los trastornos neurodegenerativos humanos y la regeneración del sistema nervioso central. Por lo tanto, presentamos el método de microinyección cerebroventricular como una forma rápida y eficiente para alterar la expresión de genes y la respuesta de la neurogénesis en el cerebro anterior adultos de pez cebra. También ofrecemos consejos para solucionar problemas y otra información útil sobre cómo llevar a cabo el procedimiento CVMI.

Introducción

Neurogénesis del adulto es un rasgo común a los vertebrados, sin embargo, su grado de prevalencia y eficiencia varía con la filogenia ^1,2,3,4,5,6. Por ejemplo, los cerebros de mamíferos adultos contienen regiones de células madre en gran parte restringidos a la prosencéfalo ^7,8, mientras que el pez cebra teleósteos contiene dieciséis dominios diferentes de células madre y las zonas neurogénicos asociados en la totalidad de su cerebro ^4,5,9,10. Esta variación entre los mamíferos y el pez cebra podría reflejar una disparidad en los mecanismos de mantenimiento de células madre y la capacidad neurogénica de las células progenitoras. La competencia de toda la vida del pez cebra para producir las neuronas en el cerebro también podría suponer consecuencias clínicas como los mecanismos moleculares utilizados por el pez cebra cerebro podrían ser aprovechadas para aplicaciones terapéuticas para hacer frente a las enfermedades neurodegenerativas en seres humanos.

Células madre de varias zonas del cerebro de pez cebra adulto han sido analizados y se ha demostrado que lacélulas que recubren la superficie ventricular de esas regiones sirven como células progenitoras ^9,11-20. Los análisis detallados en el telencéfalo pez cebra, por ejemplo, identifican las células gliales radiales, que delimitan la superficie ventricular de esta región del cerebro que ser progenitores neurogénicos ^{19, 20.} Esto es válido para otras regiones, como el cerebelo y el techo óptico, donde-ubicado ventricularly células neuroepiteliales proporcionan la entrada neurogénica ^16,21. Para este fin, la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la competencia neurogénica generalizada en el cerebro del pez cebra adultos requiere la manipulación de la expresión génica en las células progenitoras.

Varios métodos se han descrito anteriormente para la modulación de la función de genes en el pez cebra. Estos incluyen la generación de líneas transgénicas que expresan variantes condicionales deseados de una única proteína inyecciones focales, basados ​​en plásmidos acoplados a electroporación o tratamientos químicos. Anteriormente hemos diseñado unmétodo para la administración de diversas sustancias, incluyendo oligonucleótidos de morfolino o proteínas en el cerebro del pez cebra adultos usando microinyección cerebroventricular como una forma rápida y eficiente de modulación de la función de genes en las células ventriculares del adulto pez cebra cerebro anterior ^22. En nuestros estudios, morfolinos in vivo se utilizan debido a su química que implica la molécula de morfolino unido covalentemente a péptidos ricos en arginina de entrega, que permiten la entrega eficiente a las células de interés sin necesidad de permeabilización adicionales, tales como la electroporación ^23. Esto permitiría una orientación completa del tejido deseado después de la inyección, al igual que lo observado en adultos de pez cebra telencéfalo ^22. El uso de morfolinos in vivo son por lo tanto superior a los métodos ya existentes de los tejidos dirigidos tales como electroporación o inyección focal de moléculas de ADN.

Aquí, se demuestra visualmente cómo llevamos a cabo esta operación y proporcionar unprotocolo paso a paso. Comenzamos con la explicación de la preparación de la mezcla de inyección y el pescado para ser inyectado, y proceder mediante la demostración de cómo el aparato de inyección está configurado. Proporcionamos una descripción del método de inyección de cerebroventricular, que implica la generación de una incisión en el cráneo y la inyección de los morfolinos utilizando microinyector. También dio detalles sobre los puntos críticos es necesario ser cauteloso durante todo el procedimiento declarando como optimización o guías de solución de problemas.

Protocolo

1. Preparación de la mezcla Inyección

1. Usa morfolinos in vivo como células ellos internalizan de manera más eficiente que las moléculas de morfolino normales. Consulte la información del fabricante para obtener más información (Tabla 1: Reactivos y materiales).
2. Utilice un colorante fluorescente de seguimiento (por ejemplo, CellTracker Rojo CMTPX, Invitrogen) para visualizar la exactitud de la inyección. Este colorante se metaboliza en la célula y se vuelve fluorescente sólo en la célula después de la absorción. Por lo tanto, este paso es crucial para determinar las células que están dirigidos de manera eficiente por la microinyección cerebroventricular.
3. Preparar salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH: 7,4) para la dilución de solución morfolino. Si se requiere una dilución de la solución de morfolino, utilice siempre PBS.
4. Preparar 10 l de la mezcla de inyección mediante la adición de 9 l de la solución morfolino y 1 l de the célula de seguimiento de tinte (diluido o sin diluir la concentración de reserva de la solución morfolino es 500 mM Nuestros resultados previos ²² indican que varias dosis diferentes del morfolino -.. entre 50 mM y 500 mM - dan lugar a diferentes niveles de la caída de un sistema eficiente caída de fenotipos hypomorphic). 1 l de solución es suficiente para la inyección en un cerebro de pez cebra.
5. Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente hasta que la inyección.

2. Preparación del aparato de inyección

1. Preparar la inyección de capilares de vidrio con un extractor de aguja. Utilice los siguientes parámetros: valor del ciclo de calefacción: 463, tirando de valor del ciclo: 230, velocidad: 1,5 seg, tiempo: 75 ms.
2. Encienda la fuente de presión y ajustar los parámetros de presión de 50 psi o 3,5 bares.
3. Ajuste la configuración microinyector los siguientes: mantener la presión de 20 psi, la presión de expulsión de 10 psi, el valor de tiempo de 2,5 ms y 100 rango de gating.
4. Vueltaen el anillo de luz y localizar el anillo sobre la platina del microscopio.
5. Coloque el soporte capilar a una posición apropiada al lado del microscopio.
6. Insertar el capilar de vidrio en el soporte. Ajustar el ángulo de inyección a 45 grados.
7. Encaje de la punta de la capilar de vidrio usando un fórceps fino de gama y calibrar la salida de presión desde el orificio. Esta debe ser probado mediante la inmersión de la punta de la aguja en el pescado de agua y dando un impulso de presión continua. Las burbujas de aire resultantes deben ser sólo una fila, que es una indicación de la presión óptima / tamaño del orificio. Por favor, vea el video de demostración de esta calibración.
8. Cargue el capilar de vidrio con la solución de la inyección sin atrapar burbujas de aire.
9. Aplicar presión para eliminar el aire entre la punta del capilar de vidrio y la solución de inyección cargado.

3. Anestesia

1. Preparar la solución madre de los anestésicos (0,1% MESAB - etil-m-aminobenzoato de metanosulfonato).
2. Retire número deseado de peces de los tanques a las jaulas de ratón de plástico u otro contenedor de transporte con suficiente cantidad de agua.
3. Prepare la solución de la anestesia en una pequeña caja de plástico mediante la mezcla de 200 ml de agua pescado con 5 ml de solución de anestésicos. La concentración final de la anestésicos: 0,0025% (v / v).
4. Media llenar un plato de plástico Petri con anestésicos. Utilice este plato para preparaciones inyectables.
5. Incubar los peces en los anestésicos hasta las somete peces.

4. Incisión y Microinyección cerebroventricular

1. Retire el pescado de la caja con una red de pesca y colóquelo en la caja de Petri.
2. Aplique suavemente el pescado con el fórceps y orientar la cabeza de una manera que se inclina ligeramente hacia abajo. Esto facilitará la incisión.
3. Generar una pequeña hendidura en el cráneo con una aguja de púas de fin de calibre 30. Utilice sólo la punta de la aguja y no penetran más delo suficiente en el cerebro ya que esto puede ocasionar daños al tejido cerebral y se manifestará como sangrado.
4. Sigue sosteniendo el pez e inserte la punta del capilar de vidrio a través del sitio de la incisión.
5. Oriente la punta del capilar de vidrio hacia el telencéfalo. Evitar tocar el tejido cerebral ya que esto crea daños en los tejidos y también impide la dispersión de la solución inyectada.
6. Inyectar la solución. El líquido se dispersa inmediatamente después de la inyección.

5. Recuperación y análisis de la precisión de inyección

1. Retire el pescado de la configuración de la inyección y el lugar en una caja de plástico con peces de agua dulce.
2. Permitir la recuperación.
3. Vuelva a anestesiar a los peces con el 0,0025% MESAB brevemente y comprobar el pez bajo el microscopio de fluorescencia. Una dispersión a fondo de la fluorescencia roja es una indicación de la amplia distribución del líquido inyectado.
4. Ponga el pescado de nuevo a la caja de plástico.
5. Conecte la caja de plástico para tque el sistema de circulación para oxigenar el pescado y mantener durante períodos de tiempo más largos.
6. Utilice el pescado para los propósitos deseados, tales como los análisis de comportamiento o sacrificar los animales en puntos de tiempo deseados después de la inyección para preparar muestras de tejido para análisis posteriores (tinciones histológicas, inmunohistoquímica, etc). Las siguientes referencias proporcionan ejemplos de cómo analizar el cerebro de pez cebra adulto: ^{9,11,17-20,24-27.} El tiempo más rápido para observar una caída eficiente (más de 50% desmontables) era 12 horas en nuestros estudios ^22.

6. Controles científicos sugeridos

1. Utilice un morfolino molécula de falta de coincidencia que no se supone para causar cualquier fenotipo como un control negativo. Utilice una molécula de morfolino estándar o diseño específicamente controles morfolino para cada gen de interés. Además, utilizar el disolvente (en este caso PBS) como un control negativo adicional para evaluar los efectos no específicos o de toxicidad de la mismatch / controlar morpholino inyecciones.
2. Utilizar PCNA morfolinos descrito previamente ²² como controles positivos. Este morfolino causa caída eficiente en el cerebro del pez cebra adulto (75-95% de eficiencia caída dentro de 1 día de la inyección) ^22.

Resultados

Microinyección cerebroventricular conduce a la amplia distribución de la solución inyectada

Usando el esquema de flujo de trabajo y la técnica de la microinyección cerebroventricular representado en la Figura 1, se administraron oligonucleótidos de morfolino en el cerebro del pez cebra adultos. Un protocolo de inyección precisa conduce a la dispersión del líquido inyectado a través del cerebro y eficiente focalización de las células cercanas a la superficie ventricular (Figura 2A). Inyecciones donde el capilar de vidrio empala el tejido cerebral tendrán una señal fluorescente densa en el punto de la inyección (Figura 2B). Si la cantidad inyectada no es suficiente, se observó señal fluorescente débil (Figura 2 C).

Microinyección cerebroventricular se puede utilizar para derribar la expresión génica en la región del ventrículo del cerebro adultos de pez cebra

Hemos demostrado ªen morfolinos in vivo puede penetrar unos pocos diámetros de células dentro de la superficie ventricular y por lo tanto pueden dirigirse de manera eficiente las células ventriculares (Figuras 3A, 3B). Inyección de morfolino pueden expresión de genes desmontables ya que aliviará la producción de la proteína correspondiente (un ejemplo es PCNA como se muestra en las figuras 3C, 3D). Hemos demostrado previamente que derribar genes utilizando esta técnica conduce a consecuencias funcionales durante la neurogénesis adulta (Figuras 3E, 3F) o respuesta regeneración (Figuras 3G, 3H). Hemos demostrado que el rango de caída eficiente (más de 50% desmontables) se consigue aproximadamente 12 horas después de la inyección de la morfolinos ^22. También se observó que período de caída eficiente es hasta aproximadamente 5 días después de la inyección de la proteína PCNA ^22. Más de 70% desmontables fue visto hasta 3 días después de la inyección ^22. Las curvas son desmontables o dependienten el nivel de expresión de las proteínas endógenas y la eficiencia de las moléculas de morfolino, y tiene que ser determinada para cada gen por el experimentador. En nuestros estudios, no hemos visto que el procedimiento CVMI pone en peligro la supervivencia del animal, probablemente debido a que la administración de las moléculas morpholino es local y no causa una toxicidad sistémica.

Figura 1. Representación esquemática de la técnica de inyección cerebroventricular. (A) La inyección se realiza desde el dorsal del pez cebra adultos (1) en el nivel de techo óptico (OT, 2). Se hace una incisión sobre la placa de cráneo tectal óptica con una aguja de calibre 30 (3). Uso de capilares de vidrio, las moléculas de morfolino se inyectan en el líquido ventricular (4). Una dispersión a fondo es unachieved instantáneamente (5). (B) La cánula y su extremo de púas se muestra en la alta ampliación. (C) La orientación de la aguja antes de la incisión. (D) La incisión es un círculo y se indica por líneas de trazos. (E) La inyección capilar está situado como se muestra y se lleva a cabo la inyección. Todos los paneles fueron adaptadas de ref. ^22. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2. Comparación de la eficiencia de inyección y la precisión. (A) Una buena inyección conduce a la orientación de las células cercanas a la superficie ventricular. (B) Si se introduce el vaso capilar en el tejido cerebral, lo que generará una señal de fluorescencia céntrico. (C ) Si la cantidad de inyección es baja, esto dará lugar a la menor señal de fluorescencia.

Figura 3. . Morpholino penetración, eficiencia de caídas de genes y las consecuencias funcionales (A) GFP inmunotinción de las secciones transversales telencefálicas del control morpholino inyectado Tg (H2A: GFP) línea transgénica que muestra núcleos GFP-positivas. (B) GFP inmunotinción de las secciones transversales telencefálicas de gfp antisentido morpholino inyectado Tg (H2A: GFP) línea transgénica que muestra núcleos GFP-positivas. Tenga en cuenta la diferencia en la señal de GFP en la región ventricular. v: ventrículo. (C) PCNA inmunotinción en el control de morfolino-inyectado cerebro que muestran la distribución generalizada de células PCNA positivas. ( D) PCNA PCNA inmunoticción en antisentido morpholino cerebros de inyección que muestran significativamente reducidas cantidades de células PCNA positivas, demostrando que CVMI lata desmontables genes endógenos. (E) y BrdU HuC / D inmunotinción en el control morpholino-inyectados cerebros para determinar las neuronas recién nacidas después de un experimento BrdU pulso-caza descrito antes de los ^22. (F) y BrdU HuC / D inmunotinción de PCNA cerebros antisentido morpholino-inyectados para determinar las neuronas recién nacidas después de un experimento BrdU pulso-caza descrito antes de los ^22. (G) Golpear-PCNA hacia abajo conduce a una reducción significativa en la generación de neuronas recién nacidas, lo que indica que CVMI se puede utilizar para desmontables genes endógenos, que dan lugar a consecuencias funcionales. Todos los paneles fueron adaptadas de ref. ²² Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Discusión

El método se describe aquí permite la administración fácil y rápida de morfolinos en el cerebro del pez cebra adulto. Hemos demostrado que nuestro método de inyección bloquea eficientemente la expresión génica en las células ventriculares y resultados en consecuencias funcionales en la respuesta de la neurogénesis.

Hay puntos importantes para ser cautelosos acerca al ejecutar la microinyección cerebroventricular. Por ejemplo, el efecto de las moléculas de morfolino depende de la concentración utilizada. Esta concentración tiene que ser determinada por el usuario final. Se recomienda a partir de la solución madre (500 M) y la realización de diluciones en serie, y lo ideal sería que antes de la prueba por inyección en embriones utilizando protocolos estándar embrión inyección ^28-30. Anteriormente, se obtuvieron diferentes niveles de eficiencia de caída con concentraciones de morfolinos que van desde 50 mM a 500 mM ^22. En segundo lugar, el orificio del capilar de vidrio no debe ser large ya que esto dará lugar a una amplia afluencia de líquido en el cerebro después de la inyección. Del mismo modo, la abertura no debe ser demasiado estrecha ya que esto evitará inyección adecuada. Se puede determinar la combinación óptima orificio de presión por bombeo de aire en una placa de Petri con agua. Las burbujas de derivados deben estar en una sola fila, pero no en múltiples filas. Se demuestra esto en el video. En tercer lugar, la incubación de los peces en los anestésicos es crítico. El pescado no debe tener más de 2 min de los anestésicos. Esto obstaculizará la tasa de recuperación después de la inyección. En cuarto lugar, la localización de la incisión es crítico para dispersar a fondo el líquido inyectado. La región ventricular en el techo óptico es más grande por encima de la línea media y se estrecha lateralmente. Por lo tanto, el experimentador debe generar la hendidura en el cráneo cerca de la línea media y justo caudal a la placa de cráneo que cubre la región telencefálica.

Una de las ventajas de la Inyección de cerebroventricularn método (CVMI) es su Rapidness. CVMI es un método rápido para analizar la función de genes. Esta característica es importante y útil en comparación con la generación de líneas transgénicas para estudios funcionales, que generalmente toman varios meses. Además, CVMI conduce a una distribución uniforme del líquido inyectado y por lo tanto proporciona una manipulación relativamente exhaustivo de la actividad del gen, cuando se compara con las inyecciones de coordinación o de electroporación. Con CVMI, múltiples genes pueden ser derribados simultáneamente prepara la inyección de mezcla que contiene múltiples morfolinos oligonucleótido. CVMI se puede utilizar para inyectar diferentes concentraciones de un determinado oligonucleótidos de morfolino, y por lo tanto se puede utilizar para el análisis de fenotipos hypomorphic. Por último, este paradigma inyección no causa toxicidad o comprometer la supervivencia de los animales.

La técnica CVMI podría ampliarse a otro tipo de estudios, como la inyección de péptidos moduladores, las drogas, el ADN plásmido o modulador RNA molecules u otras sustancias que pudieran afectar a la fisiología de las células. Ensayo combinación de moléculas y la realización de análisis de dosis-respuesta son posibles con este método, lo que permite el estudio de fenotipos hypomorphic. Con estas propiedades, CVMI demuestra ser un ensayo rápido y fácil para los estudios de expresión en el cerebro adultos de pez cebra, y se abre de detección rápida y análisis funcionales.

El pez cebra cerebro adulto puede producir constitutivamente nuevas neuronas a lo largo de todo el eje rostrocaudal y también puede regenerarse después de lesiones traumáticas. Esto está en marcado contraste con los cerebros de los mamíferos con la neurogénesis limitado y en todo caso, más bien pobre capacidad de regeneración. Tal actividad de células madre generalizada y la capacidad de recuperación de pez cebra hace un organismo modelo útil para la comprensión de los programas moleculares necesarios para la regeneración del sistema nervioso central, que actualmente son en gran parte desconocidos. Por lo tanto, la investigación de la base molecular de la capacidad regenerativa de zebrafish cerebro es un interesante campo de investigación que podría explicar la diferencia fundamental la forma de pescado y de mamíferos cerebros reaccionan después de una lesión, y también dotar avenidas para terapias médicas regenerativas en los seres humanos. Para entender la infraestructura molecular de vertebrados plasticidad cerebral y la regeneración, las células gliales constituyen un área de investigación importante, ya que son los progenitores neurogénica ^3,8,20. Por lo tanto, utilizando la técnica de CVMI para alterar la función del gen en las células gliales radiales del cerebro del pez cebra es instrumental en la aclaración de cómo el cerebro de pescado puede actividad progenitora pareja para neurogénesis adulta eficiente y respuesta regenerativa. Recientemente hemos demostrado la implicación y exigencia de varios factores y vías de señalización en la respuesta regenerativa neurogénesis del cerebro de pez cebra adultos ^24,26,27, y estos estudios fueron posibles gracias a la utilización del método CVMI. En general, el conocimiento que obtenemos de pez cebra cerebro podría ser aprovechada para imponer regenecapacidad figurativa a las células gliales de mamífero que reaccionan a las lesiones y que por lo tanto, ayudar a diseñar terapias clínicas para trastornos neurológicos humanos y lesiones agudas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo/Material
CellTracker Red CMTPX	Life Technologies, Invitrogen	C34552	Uso en dilución 1:100 para medir la precisión de la inyección
MESAB (etil-m-aminobenzoato metanassulfonato)	Sigma-Aldrich	A5040	Para anestesiar el pescado
Placas de Petri	Sarstedt	821.472	Para la manipulación del pescado durante la inyección y la obtención de imágenes
solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies, GIBCO	10010-056	Como medio de dilución estéril
Vivo morpholinos	Gene Tools Inc.	Personalizado	Más información sobre vivo morpholinos: www.gene-tools.com
Equipment
Aguja de púas	Becton-Dickinson	305178	Para generar la incisión en el cráneo
Microscopio de disección	Olympus, Leica, Zeiss	Varía según el fabricante	Parte de toda la configuración de la inyección
Pinzas Dumont	World Precision Instruments	501985	Para romper la punta del capilar de vidrio Cámara de
fluorescencia	Zeiss, Nikon, Leica	Varía según el fabricante	Para visualizar la fluorescencia después de la inyección
Pinzas de disección Gillies	World Precision Instruments	501265	Para mantener el pez en posición
Inyección de vidrio capilares	World Precision Instruments	TWF10	Para microinyección
Kit PicoNozzle (soporte para microinyectores)	World Precision Instruments	5430-12	Para microinyección
PicoPump neumático (microinyector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	Para microinyección
Iluminador de anillo; Guía de luz anular	Parkland Scientific	ILL-RLG	Para iluminar el espécimen