Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.
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Artículo de método
La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales
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Resumen
Resumen
Para estudiar la interacción lípido-proteína en una manera reduccionista, es necesario incorporar las proteínas de membrana en membranas de composición de lípidos bien definido. Estamos estudiando los efectos de compuerta lípido-dependientes de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo (Kv), y se han elaborado procedimientos detallados para reconstituir los canales en diferentes sistemas de membranas. Nuestros procedimientos de reconstitución toman consideración de tanto la fusión inducida por detergente de las vesículas y la fusión de proteína / detergente con las micelas lípido / detergente micelas mixtas, así como la importancia de alcanzar un equilibrio de distribución de los lípidos entre la proteína / detergente / lípido y el detergente / lípidos micelas mixtas. Nuestros datos sugieren que la inserción de los canales en las vesículas lipídicas es relativamente aleatoria en orientaciones, y la eficacia de reconstitución es tan alta que no hay agregados de proteínas detectables se observaron en experimentos de fraccionamiento. Hemos utilizado el reconstituird canales para determinar los estados conformacionales de los canales en diferentes lípidos, registrar las actividades eléctricas de un pequeño número de canales incorporados en bicapas lipídicas planas, pantalla para ligandos específicos de conformación de una biblioteca de fagos, y apoyar el crecimiento de cristales 2D de los canales en las membranas. Los procedimientos de reconstitución descritos aquí se pueden adaptar para el estudio de otras proteínas de membrana en bicapas lipídicas, especialmente para la investigación de los efectos sobre los lípidos en los canales iónicos dependientes de voltaje eucariotas.
Introducción
Células materiales de intercambio e información con su entorno a través de las funciones de las proteínas de membrana específicos 1. Las proteínas de membrana en membranas celulares funcionan como bombas, canales, receptores, enzimas intramembrane, enlazadores y simpatizantes estructurales a través de membranas. Las mutaciones que afectan a las proteínas de la membrana se han relacionado con muchas enfermedades humanas. De hecho, muchas proteínas de membrana han sido los principales objetivos de drogas porque son importantes y de fácil acceso en las membranas celulares. Por lo tanto, es muy importante para comprender la estructura y la función de varias pr....
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Protocolo
1. Expresión y purificación de KvAP canal (Figura 1)
- Trabajo De Preparación - Día 0
- Enjuagar los matraces de vidrio para el cultivo bacteriano con agua desionizada (diH 2 O) y H2O MilliQ (MQH 2 O) para eliminar trazas de detergente de lavado de vajillas en general.
- Autoclave 1.000 ml de medio LB en 2.8 L Erlenmeyer (un total de dos litros de la cultura como un ejemplo aquí). Se encontró baja dureza del agua a ser importante para el éxito del cultivo de las bacterias transformadas.
- Autoclave de 100 ml de medio LB en matraces de 500 ml
- Transformar 60 l de células competentes XL1-Blue con....
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Resultados
El flujo general de los experimentos para la purificación de la canal en KvAP homogeneidad bioquímica se describe en la Figura 1A. Las muestras típicas durante la expresión y purificación de la proteína se mostraron en el gel de SDS-PAGE en la Figura 1B. La proteína después de la purificación IMAC es relativamente puro. El rendimiento de la canal KvAP es de aproximadamente 1,0 mg / litro de cultivo.
La solubilización de las vesículas lipídicas con detergente.......
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Discusión
La reconstitución de los canales KvAP en diferentes membranas se ha utilizado en varios estudios 8-10. Siguiendo la idea de asegurar la distribución de los lípidos entre detergentes / lípidos micelas mixtas y las micelas mixtas proteína / detergente / lípidos, que son capaces de llegar a la reconstitución casi completa del KvAP en las membranas hechas de muy diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric necesita ~ 100 moléculas de lípidos para cubrir totalmente su dominio transmembrana. El requisito esencial.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los estudios sobre KvAP en el laboratorio de Jiang han obtenido una ayuda importante desde el laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon, de la Universidad Rockefeller. Un agradecimiento especial al Dr. Kathlynn Brown y Michael McQuire por sus consejos y ayuda en nuestros experimentos de pantalla fago. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (GM088745 GM093271 y de Q-XJ) y la AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Triptona | RPI Corp. | T60060 | |
| Extracto de levadura | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Cloruro de potasio | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecil-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | |
| n-Octyl-β-D-Glucósido | Affymetrix | O311 | Aprotinina de grado anaico |
| RPI Corp. | A20550-0.05 | ||
| Leupeptina | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatina A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Lípidos Polares | 850757C | |
| POPG | Avanti Lípidos Polares | 840457C | |
| PERROS | Avanti Lípidos Polares | 870314C | |
| DMPC | Avanti Lípidos Polares | 850345C | |
| Biotina-DOPE | Avanti Lípidos Polares | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Lípidos Polares | 890890C | |
| NeutrAvidin perlas de agarosa | Piercenet | 29200 | |
| Tubos de diálisis | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentano | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
Referencias
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203(2005).
- Lee, A. G.
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Reimpresiones y permisos
