Artículo de método

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (

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DOI:

10.3791/50446

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25 de julio de 2013

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1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

En este artículo

Resumen

En este protocolo, se describen dos estrategias que simultáneamente suprimen dos genes (genes desmontables doble) en las abejas de miel. A continuación te presentamos cómo utilizar la respuesta de extensión probóscide (PER) de ensayo para estudiar el efecto de la caída de dos genes de la miel de abeja percepción gustativa.

Resumen

Este vídeo muestra novedosas técnicas de interferencia de ARN (RNAi), que regulan negativamente dos genes simultáneamente en las abejas que utilizan inyecciones de ARN de doble cadena (dsRNA). También se presenta un protocolo de respuesta de extensión proboscis (POR) de ensayo para la medición de la percepción gustativa.

RNAi mediada desmontables gen es una técnica eficaz disminuyendo la expresión del gen diana. Esta técnica se utiliza generalmente para la sola manipulación genética, pero tiene limitaciones para detectar las interacciones y los efectos conjuntos entre genes. En la primera parte de este video, se presentan dos estrategias para tumbar al mismo tiempo dos genes (llamados genes desmontables dobles). Mostramos ambas estrategias son capaces de suprimir de forma eficaz dos genes, vitelogenina (VG) y ultraspiracle (USP), que están en un bucle de retroalimentación reguladora. Este enfoque caída doble gen se puede utilizar para diseccionar interrelaciones entre los genes y se puede aplicar fácilmente endiferentes especies de insectos.

La segunda parte de este video es una muestra de ensayo de respuesta de extensión probóscide (PER) en las abejas de miel después de que el tratamiento de la caída de dos genes. El ensayo PER es una prueba estándar para medir la percepción gustativa de las abejas, que es un indicador clave de la rapidez con la maduración del comportamiento de una abeja es. Mayor percepción gustativa de las abejas nido indica el creciente desarrollo de la conducta que a menudo se asocia con una edad más temprana de inicio de la búsqueda de alimento y forraje especialización en el polen. Además, por ensayo se puede aplicar para identificar estados metabólicos de saciedad o hambre en las abejas de miel. Por último, por ensayo en combinación con el emparejamiento diferentes estímulos de olor para el acondicionamiento de las abejas también es ampliamente utilizado para el aprendizaje y la memoria en los estudios de las abejas de miel.

Introducción

Interferencia de ARN (ARNi) es basado en post-transcripcional silenciamiento génico de ARN, que se produce en una amplia variedad de organismos eucariotas. El proceso de ARNi se desencadena por precursores de ARN de doble cadena endógenos o exógenos (dsRNA). El ARN de doble cadena activa la proteína Dicer ribonucleasa que se une y corta el dsRNA a pequeños fragmentos (20-25 pb). A continuación, los pequeños fragmentos de la guía de dsRNA un reconocimiento y la escisión de los ARNm complementarios por las proteínas Argonaute, un componente de catalizador de complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) 1. En los mamíferos, ARN de doble cadena de más de 30 nt, activan una respuesta antiviral (respuesta de interferón, IFN) que conduce a la degradación no específica de transcripciones de ARN 2. Sin embargo, ARN de doble cadena larga han demostrado ser eficaces y específicos en los insectos ya que existe una falta de este IFN 3.

DsRNAs han sido utilizados para la regulación a la baja de los genes diana de diferentes especies de insectos. Las abejas son uno de los pionorganismos de insectos eer en el que las funciones de muchos genes importantes en el desarrollo y el comportamiento se han puesto de manifiesto mediante el uso de ARN de doble cadena 4,5. Varios métodos de entrega dsRNA se han realizado en las abejas melíferas: dsRNA alimentación regula a la baja de manera eficiente expresión del gen diana en la miel larvas de abeja 6, mientras que la inyección de dsRNA es un método eficaz para la caída de genes en embriones de abejas 4 y abejas adultas 7,8.

Efectos de derribo Gene exhibidos por la aplicación de dsRNA a los insectos son transitorios y localizados. Los estudios han demostrado que ambas inyecciones dsRNA abdominales y torácicos inyecciones dsRNA suprimen eficazmente la expresión de genes diana en las células abdominales de grasa corporal de los insectos 9,10. DsRNA se inyecta en las cavidades abdominales y torácicas y las células de grasa corporal son capaces de asumir el dsRNA de la hemolinfa donde las células están bañadas 10. Sin embargo, los genes en otros órganos, como los ovarios y el cerebro, no pueden ser dirigidos por cualquierainyecciones abdominales o torácicas. Con el fin de orientar los genes en la miel de abeja cerebro, también se ha realizado la inyección de dsRNA cerebro, lo que influye efectivamente expresión del gen diana en las zonas locales del cerebro 11. Aquí, sólo documentamos dsRNA inyección abdominal que es más comúnmente utilizado en las abejas adultas.

ARNi ha sido utilizado principalmente para llegar a un solo gen y ha sido una herramienta poderosa para revelar la función del gen. Sin embargo, cualquier gen no está aislado de los demás, es en redes reguladoras complejas. Una clave para entender un proceso biológico es diseccionar cómo los genes interactúan entre sí, lo que requiere manipulaciones simultáneas de múltiples genes en lugar de un único gen desmontables. En líneas celulares de mamíferos, los científicos han logrado inhibir simultáneamente dos o tres genes mediante el uso de sistemas de suministro de 12 o multi-microRNA (miRNA) diseños horquilla 13. Pero en los insectos, múltiples caídas de genes todavía no probado. En este sentido, Presenestrategias de inyección diferentes t que puede alcanzar una caída de dos genes. Nos dirigimos a dos genes: vitelogenina (VG) que codifica un precursor de proteína de yema de huevo, y ultraspiracle (USP) que codifica un receptor putativo de la hormona juvenil (JH) y puede servir como un factor de transcripción mediación de las respuestas a JH 14 en las abejas de miel. Vg y JH regulan entre sí en un circuito de retroalimentación 15 y están involucrados en la miel de abeja comportamiento regla 9. Con el derribo de dos genes, nos perturban tanto Vg y las vías de JH, y descubrir cómo afectan conjuntamente comportamiento de las abejas de miel y la fisiología y cómo vg, USP y JH interactúan 9.

Percepción gustativa es un predictor del comportamiento de la miel de abeja comportamiento social 16. En términos de desarrollo de comportamiento, las abejas nido con alta percepción gustativa conducta madura rápido, y por lo general forraje temprano en la vida y prefieren recoger el polen 16,17. Aunque m reglamentarioechanisms subyacen a la percepción gustativa aún no están claros, los estudios han demostrado que la percepción gustativa está relacionada con metabolismos energéticos internos 9, la secreción hormonal 18,19 y biogenética amina dirigen a las vías 20. Tanto Vg y JH son importantes reguladores hormonales modulación de la percepción gustativa 7,21. En el laboratorio, una variación de la percepción gustativa en las abejas de miel puede ser evaluada probando la respuesta de extensión proboscis (PER) a diferentes soluciones de sacarosa. Cada abeja se prueba tocando tanto sus antenas con una gotita de agua, seguido por una serie ascendente concentración de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de sacarosa. Una respuesta positiva se observó si una abeja se extiende completamente sus trompa cuando una gota de agua o sacarosa se toca para cada antena. Basado en el número de respuestas positivas a las soluciones, el nivel de la percepción gustativa de cada individuo se puede determinar 16. Sin embargo, la aplicación del POR no está limitada a la medición de gpercepción ustatory. El PER es también un método eficaz para poner a prueba el estado metabólico de las abejas, tales como el hambre saciedad vs. Las abejas con una mayor respuesta a la sacarosa tienen más hambre en general (Wang y Amdam, datos no publicados). Por otra parte, el paradigma POR también se puede utilizar en el aprendizaje y la memoria asociativa en las abejas de miel. En este caso las abejas serán entrenados para asociar la presencia de agua de sacarosa con un olor. Cuando las abejas aprenden la asociación, sólo la presencia del olor puede evocar una respuesta positiva trompa sin recompensar con la sacarosa 22,23. En este vídeo, se muestra cómo realizar PER para evaluar la percepción gustativa que se ha conectado con vg y usp doble caída en un estudio anterior 9.

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Protocolo

Parte 1: RNAi mediada desmontables de dos genes

1. dsRNA síntesis

  1. Diseño de cebadores dsRNAs dirigidos vg, USP y una proteína de control del gen que codifica la fluorescencia verde (GFP), que no está en la miel de abeja genoma: primers fueron diseñados utilizando software libre en línea Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. síntesis de dsRNA para VG, USP y GFP: uso RiboMax T7 sistema de producción de ARN de Promega para la transcripción in vitro.
  3. dsRNA purificación:
    1. Desnaturalización y renaturalización: el calor del dsRNA a 85 ° C durante 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Tratamiento con DNasa I: añadir 1 l de DNasa I en cada reacción de dsRNA y mezclarlas con un movimiento rápido de los tubos. Incubar durante 15 min a 37 ° C.
    3. Añadir 150 l de agua libre de nucleasa y 750 l TRizol - LS en cada reacción y mezclar suavemente les invErting el tubo. Se incuban las muestras durante 5 min a 30 ° C.
    4. Añadir 200 l de cloroformo a cada muestra. Mezclar enérgicamente durante 20 segundos. Centrifugar las muestras durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C.
    5. Transferir la fase sobrenadante de cada tubo nuevo y añadir 500 l de alcohol isopropílico en cada tubo. Mezclar invirtiendo el tubo. Incubar la mezcla durante 20 min a -20 ° C. Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 xga 4 º C.
    6. Eliminar el sobrenadante y el uso de 1,000 l de etanol 75% para lavar el sedimento. Después de centrifugar el tubo durante 5 min a 7500 xg a 4 ° C, el aire seco del dsRNA de pellets, y el uso de agua libre de nucleasa para disolver el precipitado. Con el fin de garantizar la eficacia del gen de la regulación a la baja, la concentración de ARN de doble cadena debe estar alrededor de 9 -10 g / l.

2. dsRNA inyección abdominal

Por gen desmontables doble, hay dos estrategias: 1) una sola inyección: dsRNA mezcla de dos genes y Inject la mezcla; 2) de dos días de inyección: inyectar la primera orientación dsRNA un gen en el primer día, e inyectar el segundo ARN de doble cadena en las mismas abejas en el segundo día.

  1. Chill recientemente surgió abejas en un refrigerador 4 ° C durante 1-2 min. Cuando se inmovilizan las abejas, las abejas 3-4 montar en paralelo en placas de Petri llenas de cera sólida con alfileres de insectos cruzadas entre el abdomen y thoraces.
  2. Enfríe las abejas de nuevo en un ° C refrigerador 4. Asegúrese de que las abejas son completamente inmóvil. Se tarda unos 1-2 min. Las abejas deben buscar suelto. Si las abejas se vuelven arrugadas o retorcida, significa que se enfrían demasiado tiempo que deben evitarse. Tiempo libre demasiado provoca una alta mortalidad, pero inmovilización completa es importante ya que cualquier movimiento aumenta el tamaño de la herida y la mortalidad.
  3. Coloque una aguja desechable 30G (BD) en un micro jeringa Hamilton. Tome 3 l dsRNA y asegúrese de que no hay burbujas de aire en la jeringa. La aguja se introduce a un lado del abdomen para evitar la damaging órganos internos. Presione el émbolo de la jeringa lentamente para permitir que el ARN de doble cadena para ser absorbido. Desde dsRNA es muy viscoso, que se necesita 2-3 seg para ser completamente expulsado de la jeringa. Tras completamente empujando hacia abajo el émbolo, deje la aguja en la herida durante 4-5 segundos. Observar las abejas para 3-5 segundos después de las inyecciones. Si un hemolinfa fugas gotita de la herida, desechar la abeja.
  4. Usar diferentes colores para marcar sus Thoraces correspondientes a diferentes tratamientos. En este punto, si se utiliza la estrategia de inyección única, las abejas pueden colocarse de nuevo en una colonia después de 1 hora de observación. Sin embargo, si se utiliza la estrategia de inyección de dos días, después de haber sido inyectados con la primera dsRNA, las abejas deben ser colocados en una jaula de malla de cilindro con miel suministrado en el lado y se mantuvieron en una incubadora a 34 ° C y 80% de humedad .
  5. En el segundo día, siga los pasos 2.2 y 2.3 para relajarse de las abejas en las jaulas de malla y montarlos en placas de cera. Realizar inyecciones con la segunda dsRNA como es descricama en el paso 2.4.
  6. Que las abejas se recuperan a temperatura ambiente durante 1 hora y los introducen en una colonia.

Nota: efectos Desmontables pueden ser detectados por RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y el Western Blot. En general, la eficacia de abatimiento varía y depende de muchos factores. En nuestro estudio, la caída de dos genes puede ser detectada 7 días después de las inyecciones individuales y las inyecciones de dos días.

Parte 2: Ensayo de respuesta de extensión probóscide (PER)

1. Recopilación de las abejas de la colmena

El día 6 después de las inyecciones, recoger las abejas tratadas de la colonia sin el uso de un fumador. Recoge las abejas en las jaulas de los cilindros de malla metálica. 3 Mantenga las abejas en cada jaula.

2. Abejas de montaje para PER

Enfríe las abejas a 4 ° C hasta que estén completamente inmovilizados. Monte cada abeja verticalmente en un tubo de plástico especialmente diseñada para PER. Mantenga el abdomen dentro del tubo por using dos pequeños trozos de cinta, y mantener la cabeza que sobresale del tubo. Colocar los tubos en un bastidor con dos filas de pequeñas columnas de plástico, y asignar a cada tubo (abeja) con un número de identificación. Luego ponga las abejas tratadas en los bastidores en una incubadora (34 ° C y 80% de humedad) y mantenerlos en la incubadora durante 2 horas.

3. Preparar una serie de sacarosa Water Solutions

Preparar 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30% de sacarosa soluciones de agua y la carga de las soluciones en jeringas con agujas G 15-20.

4. Por ensayo

Toque antena de la abeja con una gotita de solución de 0% (agua), seguido de 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30% de agua soluciones de sacarosa. Pruebe todas las abejas con agua primero y deje por lo menos dos minutos, ya que el intervalo entre cada solución se utiliza. Por lo tanto, solemos tener al menos 20 abejas de cada ensayo. Si una abeja se extiende plenamente sus probóscide, se cuenta una respuesta positiva.

5.Gestión de datos

Sume el total de respuestas positivas para cada individuo de la puntuación respuesta gustativa (GRS). Realizar un análisis estadístico adecuado de los datos.

Parte 3. Validación derribo Gene

Cuerpos gordos son disecados de otro conjunto de 7-días abejas tratados antiguos. Un procedimiento TRizol estándar se utiliza para la extracción de ARN, que es seguido por tratamiento con DNasa I 24. Vg y la expresión génica USP es analizada por un paso de dos QRT-PCR. Actina se usa como un gen de referencia, ya que tiene expresiones estables en diferentes tejidos de las abejas melíferas. Publicado cebadores de PCR en tiempo real para VG y usp gen se utilizan en el experimento 24. Los datos se analizaron mediante el uso de Delta-Delta método CT 25.

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Resultados

Tanto los dos días de la inyección estrategias de inyección única y redujeron significativamente vg (One-way ANOVA, p <0.001) (Figura 2A) y USP (One-way ANOVA, p <0.001) (Figura 2B), los niveles de transcripción en las abejas de miel seis días después de la dsRNA se inyectó. La supresión de la USP transcripción mediante el uso de la inyección única con la mezcla de ARN de doble cadena y la inyección de dos días con VG primera y segunda USP (...

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Discusión

Nuestro estudio es el primer intento de tumbar al mismo tiempo dos genes en los insectos adultos. Nuestros resultados muestran que las dos estrategias de dsRNA inyecciones (inyección única y de inyección de dos días) son eficaces para la supresión génica doble, simultánea y silenciamiento de los genes de VG y la USP pueden ser probados 6 días después de las inyecciones de dsRNA en abejas 8,9. Sin embargo, el gen de la eficacia caída varía en las diferentes especies de insectos según el nivel...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Erin Fennern para ayudar experimento. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Noruega (180.504, 185.306 y 191.699), PEW Charitable Trust y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA P01 AG22500).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bolas de PCR de GE Healthcare en placa de 96 pocillosGE Healthcare27-9557-01
QIAquick PCR kit de purificaciónQiagen28104
RiboMax T7 Sistema de producción de ARNPromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
Cloroformo:Alcohol isoamílico 24:1Sigma-AldrichC0549
alcohol isopropílicoSigma-AldrichI9516
Micro jeringa HamiltonHamilton80301
30G BD agujas desechablesBD Biosciences305106
SacarosaSigma-Aldrich84097
1 ml JeringaBD Biosciences30960
Microscopio de disección estereoscópicaLeica MicrosystemsS6D
Alfileres de insectosFine Science Tools26000-25
Placa
de cera

Referencias

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