La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Resumen

Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

Resumen

Microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo se ha convertido en una herramienta poderosa en el estudio de muchos procesos biológicos a nivel de una sola célula. En particular, las películas que representan la dependencia temporal de la expresión génica dar una idea de la dinámica de su regulación, sin embargo, hay muchos desafíos técnicos para la obtención y el análisis de las películas de fluorescencia de las células individuales. Se describe aquí un protocolo simple utilizando un dispositivo de cultivo de microfluidos disponibles comercialmente para generar dichos datos, y una interfaz basada en MATLAB gráfica de usuario (GUI) basada en paquete de software para cuantificar las imágenes de fluorescencia. Los segmentos de software y células pistas, permite al usuario vicario visualmente errores en los datos, y asigna automáticamente linaje y tiempos de división. La interfaz gráfica de usuario analiza aún más la serie de tiempo para producir trazas de células enteras, así como sus derivados primero y segundo tiempo. Mientras que el software fue diseñado para S. cerevisiae, su modularidad y versatilidad deben permitir que to Servir como plataforma para el estudio de otros tipos de células, con algunas modificaciones.

Introducción

Análisis individual de células de la expresión génica ha impulsado nuestra comprensión de muchos aspectos de la regulación de genes. Instantáneas estáticas de expresión reportero fluorescente utilizando citometría de flujo o microscopía proporcionan información útil sobre la distribución de la expresión de una sola célula, pero carecen de la historia y la evolución de los datos de series de tiempo requeridos para informar directamente dinámica de la expresión de genes. Fluorescencia microscopía de lapso de tiempo presenta un medio para obtener ambas medidas unicelulares y su historia. Diversas técnicas experimentales y analíticos se han desarrollado para obtener y cu....

Protocolo

1. Obtener fluorescentes Microscopía Películas de células individuales de levadura que crece en una Cámara Microfluidic

1. Inocular 1 ml de medio SC (medios definidos sintéticos con 2% de glucosa y el complemento completo de aminoácidos) con células de una placa recién creciente, y se incuba el cultivo durante la noche ~ 16 horas sobre un tambor de rodillo a 30 ° C. Preparar la cultura de modo que la final OD _{600 nm} es de ~ 0,1 para el crecimiento en fase logarítmica temprana.
2. Diluir el cultivo iniciador según sea necesario y volver a crecer 1 ml en un tubo de ensayo fresco un adicional de 6-8 horas a OD _{600 nm} = 0,1. Esto prop....

Resultados

Un experimento llevado a cabo con éxito y analizado producirá series de tiempo sobre todo continua de células enteras individuales con realismo asignado aparición del brote y los tiempos de división. Como un ejemplo, se realizó el protocolo anterior con una cepa de levadura haploide que expresa una copia integrada de la proteína fluorescente Cerulean (PPC) impulsado por el promotor ADH1 constitutivo de observar cómo el crecimiento y la expresión global pueden variar con el tiempo en las células individ.......

Discusión

El protocolo anterior se describe un método simple para obtener y analizar datos de series temporales de fluorescencia con experiencia limitada en la microfluídica o en el desarrollo de software. Esto permite obtener películas a intervalos de fluorescencia de las células individuales de levadura, extracto de tamaño de la celda correspondiente y las mediciones de expresión; asignaciones linaje cura y seguimiento, y analizar el comportamiento de las células en su conjunto a través del tiempo mediante un dispositivo de cul.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Y04C placa de perfusión de levadura	CellAsic	Y04C-02
ONIX plataforma de perfusión microfluídica	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscopio	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objetivo	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II Cámara EMCCD	Fotometría
Lámpara de arco de halogenuros metálicos Lumen 200	PRIOR Scientific
Cubo de filtro dicroico de paso de banda triple y juego de filtros de excitación y emisión	Chroma Technology Corp	set #89006	Utilizado para YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
Controlador MAC 5000 y ruedas de filtro	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		La versión de 64 bits maneja archivos de datos grandes mejor que la de 32 bits