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Artículo de método

SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para

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DOI:

10.3791/50476

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25 de julio de 2013

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1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

En este artículo

Resumen

Desarrollamos métodos computacionales de diseño de proteínas de novo capaces de abordar varias áreas importantes del diseño de proteínas. Para difundir estos métodos presentamos Protein WISDOM, una herramienta en línea para el diseño de proteínas (http://www.proteinwisdom.org). A partir de un molde estructural, se puede realizar el diseño de proteínas monoméricas para aumentar la estabilidad y complejos para aumentar la afinidad de unión.

Resumen

El objetivo de diseño de novo de proteínas es para encontrar las secuencias de aminoácidos que se pliegan en una estructura 3-dimensional deseada con mejoras en las propiedades específicas, tales como la afinidad de unión, agonista o antagonista del comportamiento, o la estabilidad, con relación a la secuencia nativa. Diseño proteína se encuentra en el centro de diseño de fármacos actuales avances y descubrimientos. No sólo el diseño de proteínas proporcionar predicciones para dianas de fármacos potencialmente útiles, sino que también mejora nuestra comprensión del proceso de plegamiento de proteínas y las interacciones proteína-proteína. Los métodos experimentales como la evolución dirigida han tenido éxito en el diseño de proteínas. Sin embargo, estos métodos están limitados por el escaso espacio de secuencias que se pueden buscar tractably. En contraste, el diseño de estrategias computacionales permiten la proyección de un conjunto mucho mayor de secuencias que cubren una amplia variedad de propiedades y la funcionalidad. Hemos desarrollado una gama de cálculo de novo de proteínas diseño methods capaces de hacer frente a varias áreas importantes de diseño de proteínas. Estos incluyen el diseño de proteínas monoméricas para aumentar la estabilidad y complejos para el aumento de la afinidad de unión.

Para difundir estos métodos de amplio uso que presentamos SABIDURÍA Protein ( http://www.proteinwisdom.org ), una herramienta que proporciona métodos automatizados para una variedad de problemas de diseño de proteínas. Plantillas estructurales se presentan al iniciar el proceso de diseño. La primera etapa de diseño es una optimización de secuencia de fase de selección que tiene como objetivo mejorar la estabilidad a través de la minimización de la energía potencial en el espacio de secuencia. Secuencias seleccionadas se ejecutan a continuación, a través de una etapa de especificidad veces y una etapa de afinidad de unión. Una lista ordenada por rango de las secuencias para cada paso del proceso, junto con estructuras diseñadas pertinentes, proporciona al usuario con una valoración cuantitativa completa del diseño. Aquí le proporcionamos los detalles of cada método de diseño, así como varios éxitos notables experimentales obtenidos mediante el uso de los métodos.

Introducción

El diseño de proteínas de novo es la identificación de secuencias de proteínas que producirán una estructura terciaria deseada con propiedades o funciones mejoradas. Dado que el pliegue nativo de una proteína es la conformación que se encuentra en el mínimo de energía libre, el diseño de proteínas de novo busca secuencias que tengan un mínimo de energía libre en el pliegue objetivo. Este problema fue descrito por primera vez por Drexler1 y Pabo2 y se denominó el "problema del plegamiento inverso". Sin embargo, a diferencia del problema del plegamiento de proteínas, donde una secuencia puede producir solo una solución de estructura plegada, el problema de diseño de proteínas de novo exhibe degeneración. Muchas secuencias de aminoácidos diferentes pueden producir la misma estructura y función terciaria.

Mientras que el diseño de proteínas se ha realizado tradicionalmente experimentalmente a través del diseño racional y la evolución dirigida, los métodos computacionales se han empleado más recientemente para superar el limitado espacio de búsqueda inherente a los métodos experimentales. Se han utilizado una variedad de métodos computacionales, incluidos métodos deterministas, métodos estocásticos y métodos probabilísticos. 3,4 Los primeros métodos computacionales utilizaban plantillas troncales fijas para facilitar la resolución del problema. 5-7 Con el advenimiento de procesadores más rápidos, computación de alto rendimiento y algoritmos más eficientes, la flexibilidad de la red troncal se ha incorporado mediante el uso de un conjunto de plantillas de columna vertebral fija8-14 o mediante la incorporación de una verdadera flexibilidad de la red troncal expresando la plantilla en términos de rangos de distancias de átomo a átomo y ángulos diedros. 15,16

Este artículo describe en detalle Protein WISDOM, una herramienta en línea que se ha puesto a disposición de la comunidad académica para utilizar nuestro marco de diseño computacional de proteínas de novo. Este marco se ha aplicado al diseño de numerosas proteínas, para uso terapéutico dirigidas a enfermedades como el VIH, el cáncer, las enfermedades del complemento y otros trastornos autoinmunes. Muchos de los péptidos predichos fueron validados experimentalmente, demostrando el poder del método. La Tabla 1 proporciona un resumen de las diferentes proteínas que se han diseñado, incluido el tamaño de la proteína o péptido, el número de predicciones y la validación experimental.

años
Diseño de proteínasLongitud de la proteína# de Predicciones Computacionales# de Validaciones Experimentalesreferencia
Diseño de secuencia completa de beta-defensina-2 humana41340 (17)
Inhibidores de la compstatina C3 humana13283/3(18, 19)
Análogos de la compstatina que se unen a la rata C3c135 (20)
Análogos de la compstatina con extensión de di-serina158  
Estructura estabilizadora del análogo de la compstatina W4A91318  
Agonistas y antagonistas del receptor C3a77204/7(21)
Agonistas y antagonistas del receptor C5a74612/61 
Inhibidores de la gp14 del VIH-11264/5(22)
Inhibidores del VIH-1 gp120914  
Inhibidores de Bak de Bcl-x L y Bcl-2De 16 a 18105/5(23)
Inhibidores de ERK21125  
Inhibidores de EZH2211710/10(24)
Inhibidores de LSD1 y LSD2164117/20 
Inhibidores de HLA-DR1136 (25)
Inhibidores de la PNP513  

Tabla 1. Resumen de las proteínas y péptidos diseñados utilizando el marco de diseño de proteínas de novo. El # de predicciones computacionales se presenta como el número de predicciones favorables (es decir, especificidades de pliegue por encima de un cierto punto de corte o afinidades de unión aproximadas mayores que la secuencia nativa). El # de validaciones experimentales da dos números: el primero es el número de predicciones que se validaron experimentalmente, mientras que el segundo es el número total de predicciones que se probaron experimentalmente.

Se realizó el diseño de la beta-defensina-2 humana (hβD-2) para mejorar la propiedad antimicrobiana del péptido. 17 Para este diseño, consideramos dos casos: 1) hasta 10 mutaciones a lo largo de hβD-2 y 2) diseño de secuencia completa de todas las posiciones de residuos de hβD-2 excepto las cisteínas (8, 15, 20, 30, 37 y 38). En el diseño se utilizaron tres plantillas de diseño diferentes y tres modelos de selección de secuencia diferentes. Se observaron altos niveles de similitud en las mutaciones entre el promedio ponderado y los modelos de intervalo de distancia tanto para el diseño de 10 mutaciones como para el diseño de secuencia completa. Además, se encontró que un gran número de secuencias tenían valores de especificidad de pliegue calculados más favorables que la secuencia nativa.

Los inhibidores del sistema del complemento (de C3, C3a y C5a) fueron diseñados para combatir una serie de enfermedades inmunitarias como el accidente cerebrovascular, el ataque cardíaco, la enfermedad de Alzheimer, el asma, la artritis reumatoide, el rechazo de los xenotrasplantes, la enfermedad respiratoria del adulto, la psoriasis y la enfermedad de Crohn. Se validó experimentalmente que tres inhibidores de la compstatina de C3c predichos por el marco de diseño de proteínas, más tres secuencias diseñadas racionalmente, eran mejores aglutinantes que la compstatina nativa. 18,19

Estudios posteriores examinaron la pérdida de actividad de la compstatina frente a C3c no primates y diseñaron una serie de inhibidores C3c candidatos en ratas y ratones. Se demostró que cinco secuencias tienen energías libres de asociación más favorables con C3c de rata que el mutante de compstatina W4A9 conocido por inhibir C3c. Esto se debe a una nueva formación de puente salino por parte de Arg1. 20 Se predijo que ocho secuencias con una extensión N-terminal serían mejores aglutinantes que W4A9 con una extensión di-Serina. Finalmente, se predijo que 18 secuencias de compstatina estabilizarían la conformación unida de W4A9, proporcionando fuertes candidatos para inhibidores de C3c en primates y no primates.

Además de los inhibidores de C3c, se diseñaron agonistas y antagonistas de los receptores C3a y C5a basados en las estructuras de C3a y C5a. Se probaron experimentalmente siete secuencias de C3a predichas por el modelo. Dos de las secuencias eran agonistas potentes, mientras que otras dos eran agonistas parciales. 21 Los dos potentes agonistas mostraron una mejora de 58 veces sobre un "superagonista" previamente descubierto. El diseño de agonistas y antagonistas del receptor C5a proporcionó un conjunto de 61 secuencias. Se sintetizaron todas las secuencias y se encontró que dos eran nuevos agonistas C5a.

Los inhibidores de fusión del VIH-1, el virus que causa el SIDA, fueron diseñados para evitar que el VIH-1 infecte las células. El primer diseño se dirigió a gp41, una glicoproteína de la envoltura del VIH-1. El marco de diseño de proteínas predijo seis secuencias que eran mejores aglutinantes que la secuencia nativa. Cuatro de estas secuencias predichas se validaron experimentalmente para inhibir el VIH-1, y la mejor secuencia tenía un IC50 tan bajo como 29 μM. Esta secuencia mostró una mejora de 3 a 15 veces con respecto a la secuencia nativa y no tuvo pérdida de actividad contra una cepa de virus resistente a Enfuvirtida. 22 El segundo diseño se dirigió a gp120, otra glicoproteína de la envoltura del VIH-1. Se predijo que catorce secuencias serían aglutinantes de gp120 y proporcionarían potenciales inhibidores de fusión adicionales del VIH-1.

Numerosas proteínas relacionadas con el cáncer proporcionaron objetivos prometedores para la terapéutica del cáncer. Bcl-2 y Bcl-xL son proteínas antiapoptóticas que evitan la muerte celular. Los inhibidores de estas dos proteínas se diseñaron para inducir la muerte celular en las células cancerosas. Se predijo que diez secuencias serían mejores aglutinantes que las nativas, y estos resultados capturaron resultados experimentales y de mutagénesis anteriores. 23 Otra proteína diana, ERK2, está involucrada en cascadas de transducción de señales que la convierten en un objetivo prometedor para las terapias antiproliferativas contra el cáncer. Se predijo que veinticinco secuencias eran inhibidores de ERK2.

Las histonas metiltransferasas y desmetilasas controlan dinámicamente la metilación de histonas, que se ha relacionado con muchos tipos de cáncer, incluidos el de próstata, mama, linfoma, mieloma, vejiga, colon, piel, hígado, endometrio, pulmón y gástrico. El marco de diseño de proteínas de novo identificó 17 inhibidores de EZH2 (una metiltransferasa de lisina) y de los diez probados experimentalmente, se encontró que todos inhibían EZH2. 24 El péptido más potente tenía un IC50 de aproximadamente 13 μM, era igualmente efectivo con concentraciones elevadas de enzimas y no competía con el cofactor. Estos péptidos fueron el primer conjunto de inhibidores de EZH2. 53 inhibidores de LSD1 (una desmetilasa) fueron predichos por el marco y de los 20 probados experimentalmente, 17 eran inhibidores de LSD1 y 18 eran inhibidores de LSD2. Los mejores inhibidores tenían valores de IC50 por debajo de 1 μM, lo que los convierte en los inhibidores peptídicos más potentes descubiertos hasta la fecha.

Los dos últimos sistemas de proteínas proporcionaron objetivos para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes como la enfermedad celíaca, la diabetes mellitus tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, el síndrome de Sjögren, el síndrome de Churg-Strauss, la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Graves, la púrpura trombocitopénica idiopática, la artritis reumatoide y las alergias. Ninguno de estos inhibidores potenciales ha sido validado experimentalmente, sin embargo, el marco predijo seis secuencias que se unen a HLA-DR1 y 13 secuencias que se unen a PNP.

La Tabla 2 resume los inhibidores y agonistas validados experimentalmente que se predicen utilizando el marco de diseño de proteínas de novo. La métrica de afinidad de unión aproximada se utilizó para predecir nueve de las secuencias (inhibidores de C3c humano, VIH-1 gp41, EZH2, LSD1 y LSD2), mientras que la métrica de especificidad de pliegue se utilizó para identificar cuatro de las secuencias (agonistas/antagonistas de C3aR). Estos péptidos ponen de manifiesto el éxito del marco de diseño de proteínas de novo, en particular la métrica de afinidad de unión aproximada añadida. El marco es extremadamente versátil en su aplicabilidad. Se han diseñado y validado experimentalmente con éxito seis proteínas diferentes relacionadas con veinticinco enfermedades diferentes.

nombreIC50EC50Objetivo proteicoEnfermedades aplicables
SQ0270,94 μM C3c humanoaccidente cerebrovascular, ataque cardíaco, enfermedad de Alzheimer, asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, psoriasis, diabetes tipo I, enfermedad de Crohn, pancreatitis y fibrosis quística
SQ0861,98 μM C3c humano
SQ0594,73 μM C3c humano
SQ110-4 15,2 nMC3aR
SQ060-4 36,4 nMC3aR
SQ007-515,4 nM C3aR
SQ002-526.1 nM C3aR
SQ43529 - 253 μM VIH-1 gp41SIDA
SQ03713,57 μM EZH2cánceres de próstata, mama, linfoma, mieloma, vejiga, colon, piel, hígado, endometrio, pulmón y gástrico
SQ011-10,521 μM LSD1
SQ016-10,249 μM LSD1
SQ026-12,51 μM LSD2
SQ015-11.332 μM LSD2

Tabla 2. Péptidos predichos computacionalmente y validados experimentalmente dirigidos a diversas enfermedades.

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Protocolo

Resumen del método

El marco de diseño de novo utilizado en Protein WISDOM consta de dos etapas. La primera etapa genera una lista ordenada de secuencias de aminoácidos que se pliegan en una estructura molde dada. La segunda etapa valida estas secuencias mediante el cálculo de la especificidad de plegamiento o de la afinidad de unión aproximada, o de ambas. La primera se utiliza principalmente cuando el diseño corresponde a una sola proteína, mientras que la segunda se emplea cuando el diseño corresponde a un complejo (un péptido que se une a una proteína diana). Figura 1 muestra una visión general de los pasos involucrados en el marco.

Entradas de diseño: Es necesario definir varias entradas para el marco de diseño de novo de proteínas. La primera es la plantilla de diseño. Esta es una estructura tridimensional (3D) de una proteína que contiene las coordenadas de todos los átomos en la proteína. La estructura puede ser rígida o flexible. Las plantillas rígidas consisten en un conjunto de coordenadas atómicas fijas y se obtienen a partir de estructuras de cristalografía de rayos X. Las plantillas flexibles pueden ser un conjunto de coordenadas atómicas fijas o límites superiores e inferiores para las coordenadas atómicas. Estas plantillas pueden obtenerse a partir de estructuras en solución por RMN, dinámica molecular o simulaciones de acoplamiento molecular.

La plantilla de diseño se utiliza para generar el conjunto de mutaciones permitidas de la proteína diseñada. Este conjunto define qué posiciones de la secuencia pueden mutar y a qué aminoácidos. El conjunto de mutaciones se genera calculando el área de superficie accesible al solvente (SASA) de cada residuo en la plantilla de diseño. Si el residuo tiene una exposición al solvente superior al 50 %, se permite un conjunto de aminoácidos hidrofílicos (D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T). Si el residuo tiene una exposición inferior al 20 %, se permite un conjunto de aminoácidos hidrofóbicos (A, F, I, L, M, V, W, Y). Si la exposición del residuo se encuentra entre el 20 % y el 50 %, se permiten todos los aminoácidos. La cisteína normalmente se excluye del conjunto de mutaciones, a menos que datos experimentales o de la literatura indiquen lo contrario. Los aminoácidos pequeños (A, G, T) normalmente se incluyen en todos los conjuntos de mutaciones. Cuando están disponibles, se pueden utilizar conocimientos experimentales o de la literatura para modificar manualmente los conjuntos de mutaciones de posiciones específicas de aminoácidos.

Se elige un campo de fuerza para calcular la energía de interacción por pares de las secuencias en la plantilla de diseño. Aunque cualquier campo de fuerza puede adaptarse para utilizarse dentro del marco, se han desarrollado dos campos de fuerza dependientes de la distancia que se usan ampliamente en el marco de diseño de novo. El primero es un campo de fuerza de alta resolución Cα-Cα26, donde las distancias corresponden a las distancias entre los átomos de carbono Cα de los residuos. El segundo es un campo de fuerza de alta resolución centroide-centroide27, donde las distancias se miden entre los centroides de los residuos. Los parámetros energéticos de estos campos de fuerza se obtuvieron resolviendo un problema de estimación de parámetros mediante programación lineal, que requería que los modelos falsos (decoys) de alta resolución y baja energía para un amplio conjunto de entrenamiento de proteínas fueran energéticamente menos favorables que sus conformaciones nativas. Tanto el campo de fuerza centroide-centroide de alta resolución como el campo de fuerza Cα-Cα fueron previamente evaluados y validados en estudios anteriores sobre la beta-defensina-2 humana17. La verdadera flexibilidad del armazón principal (backbone) se incorpora al modelo mediante la discretización de los campos de fuerza en intervalos de distancia. La distancia entre un par de aminoácidos corresponderá a un intervalo de distancia, asignando el mismo valor energético a un rango de distancias. Esto permite que el modelo de optimización de selección de secuencias tenga en cuenta el movimiento del armazón principal.

Las restricciones biológicas, en forma de restricciones de carga o restricciones de contenido, pueden incluirse manualmente por el usuario como una entrada adicional de diseño. Las restricciones de carga especifican una carga particular o un rango de cargas que deben cumplirse para la secuencia diseñada o una porción de la secuencia diseñada. La carga se calcula como la suma de los residuos cargados positivamente (K y R) menos la suma de los residuos cargados negativamente (D y E). Las restricciones de contenido especifican límites superiores e inferiores en la frecuencia de aparición de un aminoácido particular en la secuencia. Las Restricciones Biológicas generalmente se definen mediante una alineación extensa de secuencias con la secuencia nativa. Esto tiene como objetivo capturar los límites biológicos conocidos sobre la carga y el contenido de aminoácidos presentes en la naturaleza para una familia de proteínas. Restricciones adicionales se definen manualmente mediante el análisis de datos experimentales conocidos.

Fase uno: Selección de secuencias: El método original de selección de secuencias fue desarrollado por primera vez por Klepeis et al.15,16. Selecciona y clasifica secuencias de aminoácidos según sus energías en la plantilla de diseño utilizando un modelo de optimización lineal entera (ILP). Posteriormente, el método se mejoró mediante el uso de un modelo de selección de secuencias más eficiente computacionalmente para plantillas rígidas (únicas) y se amplió mediante el desarrollo de modelos para plantillas flexibles. Este método de optimización global no depende de mutaciones aleatorias y está teóricamente garantizado para explorar completamente el espacio de secuencias y determinar una solución global. Esta es una ventaja importante de nuestro enfoque en comparación con todos los demás enfoques existentes.

Modelo de estructura única: La forma original del modelo de selección de secuencias propuesto por Klepeis et al.15,16 fue posteriormente refinada por Fung et al.28. Su forma final se muestra en la Ecuación 1.

Problema de optimización con ecuaciones, restricciones; optimización matemática, notaciones simbólicas.
El conjunto i=1,...,n define las posiciones de residuos en la plantilla de diseño. En cada posición i, las mutaciones se representan mediante j{i}=1,...,mi, donde mi=20 si se permite que la posición i mute a cualquiera de los veinte aminoácidos naturales. Los conjuntos de alias k≡i y l≡j, con k>i, se utilizan para representar todas las interacciones por pares únicas. Se introducen variables binarias yj subíndice i superíndice j, notación matemática, variables en ecuaciones. y Notación de derivada primera y'_k, ecuación, concepto de cálculo, fórmula educativa. para modelar las mutaciones de aminoácidos. La variable yj subíndice i superíndice j, notación matemática, variables en ecuaciones. asumirá el valor uno si el modelo asigna el aminoácido j a la posición i, y cero en caso contrario (análogamente para Notación de derivada primera y'_k, ecuación, concepto de cálculo, fórmula educativa.). La función objetivo representa la suma de todas las interacciones energéticas por pares en la plantilla de diseño. El parámetro Ejemplo de notación tensorial en álgebra abstracta; expresión matemática que ilustra notación por índices., que es la interacción energética entre la posición i ocupada por el aminoácido j y la posición i ocupada por el aminoácido l, depende de la distancia entre los α-carbonos o los centroides de las cadenas laterales en las dos posiciones (xi,xj,) así como del tipo de aminoácidos j y l. Este parámetro solo contribuye a la función objetivo si ambas variables yj subíndice i superíndice j, notación matemática, variables en ecuaciones. y Notación de derivada primera y'_k, ecuación, concepto de cálculo, fórmula educativa. son iguales a uno.

Fung et al.28 descubrieron que la formulación (1) es significativamente más eficiente computacionalmente que otros doce modelos cuadráticos equivalentes de asignación para la selección de secuencias.28,29 En particular, superó al modelo original propuesto por Klepeis et al.15,16 en dos problemas de selección de secuencias para la beta-defensina-2 humana: uno con un nivel de complejidad de 3,4×1045 y otro con 6,4×1037 y 49 restricciones biológicas lineales adicionales. Se encontró que el modelo original propuesto por Klepeis et al.15,16 necesitaba 53.263 segundos de unidad central de procesamiento (CPU) y 4.578 segundos de CPU, respectivamente, para resolver ambos problemas hasta optimalidad global utilizando CPLEX 9.030 en un procesador Pentium IV de 3,2 GHz. La formulación (1) solo necesitó 649 segundos de CPU y 14 segundos de CPU para realizar las mismas tareas, lo que corresponde a una mejora de 82 y 327 veces en eficiencia computacional.

Modelo de Promedio Ponderado: Fung et al.28 desarrollaron dos modelos para abordar el caso típico de diseño de novo de proteínas en el que la plantilla de diseño es flexible y contiene un conjunto de estructuras. El Modelo de Promedio Ponderado utiliza una energía promedio ponderada, Fórmula de equilibrio estático ΣE_ik^jl(x_i,x_k)wt(x_i,x_k,d), concepto matemático., en lugar del parámetro de energía Ejemplo de notación tensorial en álgebra abstracta; expresión matemática que ilustra la notación por índices.(xi,xk) del Modelo de Estructura Única (Ec. 1). Los pesos wt(xi,xk,d) se determinan a partir de las frecuencias con las que la distancia entre xi y xk cae dentro del intervalo de distancia d en las estructuras de la plantilla. La forma final del Modelo de Promedio Ponderado se presenta en la Ec. 2.

Ecuaciones del problema de optimización; modelo de programación lineal; restricciones y variables binarias; formulación matemática.
Modelo de intervalos de distancia: El segundo modelo de selección de secuencias para estructuras de plantillas flexibles incorpora la información de distancia procedente de múltiples estructuras mediante la introducción de una variable binaria bikd. Esta variable es igual a uno si la distancia entre xi y xk cae dentro del intervalo de distancia d, y cero en caso contrario. Se introduce otro parámetro, disbin(xi, xk, d), que es igual a uno si la distancia entre xi y xk en cualquiera de las estructuras de plantilla cae dentro del intervalo de distancia d, y cero en caso contrario. Dado que solo un intervalo de distancia por par de aminoácidos contribuirá a la energía total, Ejemplo de notación tensorial en álgebra abstracta; expresión matemática que ilustra la notación por índices. en la función objetivo se sustituye por Ecuación matemática Σ E(x) diagrama; equilibrio estático, fórmula de sumatoria para análisis de investigación.. Sin embargo, esto introduce no linealidad en la función objetivo. Más detalles sobre la linealización del modelo y restricciones adicionales que deben añadirse para garantizar la factibilidad se pueden encontrar en Fung et al.28 El modelo de intervalos de distancia se presenta en la ecuación 3.

Ecuaciones del problema de optimización; modelo de programación lineal; restricciones y variables binarias; formulación matemática.
Cualquiera de los problemas de programación lineal entera (PLE) formulados anteriormente15-17 puede resolverse rigurosamente utilizando técnicas de ramificación y acotación.28-30 Dichas técnicas garantizan una convergencia consistente y confiable hacia la secuencia de energía mínima global.

Segunda etapa: Validación: Figura 2 proporciona una descripción detallada de los dos enfoques de la Segunda etapa. La figura muestra los pasos necesarios para calcular la métrica final de clasificación y el número de estructuras generadas en cada paso.

Especificidad de plegamiento: La especificidad de plegamiento es una métrica utilizada para clasificar los diseños preliminares obtenidos en la Etapa Uno. El objetivo del cálculo consiste en determinar qué tan bien se pliega cada secuencia en la estructura de la plantilla en comparación con la secuencia original de dicha plantilla, basándose en cálculos de energía. Existen dos enfoques para realizar esto, cada uno con diferentes demandas computacionales.

El primer enfoque fue implementado por Klepeis et al.15,16 Este enfoque utiliza el marco de predicción de estructuras proteicas ASTRO-FOLD,26,27,31-47 que se basa en la optimización global determinista. Actualmente, este enfoque no se utiliza en la implementación de Protein WISDOM, ya que requiere una carga computacional muy elevada. Reconociendo las limitaciones de recursos computacionales y la necesidad de realizar este cálculo en potencialmente cientos o miles de secuencias durante el diseño, Fung et al.17 propusieron un enfoque más eficiente que utiliza TINKER/CYANA.48-50 El enfoque implica definir una plantilla flexible de la estructura. La plantilla flexible puede definirse mediante límites superiores e inferiores en las distancias entre los átomos Cα, así como los ángulos ϕ y ψ de los residuos. Para una sola estructura, se utilizan las distancias iniciales y los ángulos diedros, y los límites se definen ya sea como una distancia fija o como un porcentaje. Los límites predeterminados son ±10 % para las distancias Cα o ±10° para los límites de ángulos diedros. Para una plantilla flexible, los límites pueden obtenerse a partir de los valores máximos y mínimos observados en todas las estructuras de plantilla proporcionadas como entrada para el diseño. Una vez definidos los límites iniciales para cada secuencia, se generan conjuntos que contienen cientos de conformeros utilizando CYANA 2.1.48,49 Los conformeros se generan mediante un protocolo de recocido simulado por dinámica de ángulos de torsión en CYANA que calienta rápidamente la proteína y la enfría lentamente, registrando las conformaciones muestreadas. Tras el recocido simulado, se realiza una minimización local de energía que reduce los choques debidos a la superposición de radios de Van der Waals, así como las violaciones de las restricciones de distancia y ángulo. Por defecto, se generan 500 estructuras finales. Cada estructura del conjunto para cada secuencia se somete a una minimización local en TINKER 3.6,50 utilizando el campo de fuerza AMBER.51 Se tabula la energía potencial final de cada estructura minimizada. Este enfoque general se lleva a cabo tanto para la secuencia inicial como para cada secuencia mutante candidata. Luego, la Especificidad de Plegamiento de cada secuencia mutante respecto al plegamiento objetivo puede calcularse en relación con la secuencia nativa utilizando la siguiente distribución de Boltzmann (Ec. 4).

Ecuación de equilibrio estático Σ(e^(-βEi)) para estados nativos y novedosos; fórmula matemática.
Afinidad de unión aproximada: El método de cálculo de afinidad de unión aproximada se utiliza para clasificar las secuencias diseñadas que se encuentran en complejo con una proteína diana. Estos cálculos pueden realizarse directamente sobre las secuencias obtenidas de la Etapa Uno o bien sobre las secuencias con alta especificidad de plegamiento obtenidas del paso de especificidad de plegamiento.

Lilien et al.52 propusieron un enfoque para el cálculo de afinidades de unión aproximadas de complejos proteína-ligando. Se basa en la generación de conjuntos basados en rotámeros de la proteína, el ligando y el complejo proteína-ligando, y en el uso de dichos conjuntos para calcular las funciones de partición. Esta afinidad de unión aproximada se denota como K* y se define mediante la ecuación 5.

Aquí, qPL es la función de partición del complejo proteína-ligando, qb es la función de partición de la proteína libre y qL es la función de partición del ligando libre. Las funciones de partición se definen en la Ecuación 6, donde los conjuntos B, F y L contienen las conformaciones basadas en rotámeros del complejo proteína-ligando unido, la proteína libre y el ligando libre, respectivamente. En es la energía de la conformación n, R es la constante de los gases y T es la temperatura.

Ecuaciones de equilibrio termodinámico; Σe^(-Eb/RT); fórmula científica para la energía interna.
Predicción de la estructura: Para comenzar a calcular K*, se necesita una estructura tridimensional de cada secuencia. Esto se realiza utilizando la función Rosetta AbRelax,53-55 parte del paquete de software Rosetta 3.4. La estrategia detrás del algoritmo AbRelax se basa en la observación experimental de que la estructura local de la proteína está influenciada, pero no determinada únicamente, por la secuencia local de la proteína. Se utiliza un algoritmo de Monte Carlo para reemplazar las estructuras locales de la proteína con fragmentos estructurales derivados de la secuencia. Este método produce las estructuras finales compactas de la proteína que tienen en cuenta interacciones no locales, como residuos hidrofóbicos enterrados, hebras β apareadas e interacciones específicas de las cadenas laterales.

Agrupamiento: Las estructuras obtenidas de AbRelax se agrupan luego según sus ángulos φ y ψ utilizando OREO.56,57 Este método de agrupamiento permite identificar estructuras representativas del esqueleto principal dentro de todo el conjunto estructural. Se seleccionan las estructuras promedio de los diez grupos más grandes y la estructura con energía más baja en general para realizar el acoplamiento con la proteína diana. Esto proporciona 11 estructuras únicas del esqueleto principal para cada secuencia peptídica, incorporando así la flexibilidad del esqueleto principal en la generación del conjunto.

Predicción de acoplamiento: La predicción de acoplamiento se realiza utilizando RosettaDock.58-60 Para cada secuencia, cada una de las 11 estructuras del esqueleto peptídico se acopla contra la proteína diana. En este caso, dado que el sitio de unión es conocido, los péptidos se colocan cerca del sitio de unión y se les permite trasladarse 3 Å en dirección normal al sitio de unión, 8 Å en paralelo al sitio de unión y rotar 8°. RosettaDock utiliza un algoritmo de Monte Carlo para movimientos de acoplamiento a baja y alta resolución. Cada simulación de acoplamiento genera un gran conjunto de estructuras complejas. Los diez complejos con menor energía de cada una de las 11 simulaciones se utilizan como estructuras iniciales en la generación final del conjunto conformacional basado en rotámeros (110 estructuras iniciales por secuencia).

Generación del conjunto final: RosettaDesign61 se utiliza para generar el conjunto final de conformaciones basado en rotámeros porque puede generar varias estructuras ajustando únicamente los rotámeros en las cadenas laterales mediante la función fixbb. Se proporcionan al programa varias estructuras iniciales, y para cada estructura se elige aleatoriamente un residuo y se cambia su rotámero mediante un algoritmo de Monte Carlo. Este proceso se repite hasta que se intentan miles de sustituciones de rotámeros, obteniéndose así una conformación final de baja energía que contribuirá significativamente a la función de partición.

Para generar el conjunto de péptidos, se utilizan como estructuras iniciales para RosettaDesign las diez estructuras de péptidos con menor energía de cada uno de los diez grupos más grandes, además de las diez estructuras de péptidos con menor energía en general (un total de 110 estructuras iniciales). Para cada estructura inicial, se generan 200 conformeros de rotámero, obteniendo así un conjunto final de 22.000 estructuras (conjunto L en la Ecuación 6). Este conjunto incorpora tanto la flexibilidad del armazón principal como la flexibilidad de los rotámeros.

El conjunto complejo se genera de manera similar tomando las 110 estructuras iniciales del paso de predicción de acoplamiento y generando 200 conformeros rotámericos por cada estructura inicial. El tamaño final del conjunto es de 22.000 estructuras (conjunto B en la Ec. 6). La flexibilidad se tiene en cuenta mediante las diversas estructuras del armazón peptídico utilizadas, las distintas conformaciones acopladas y los conformeros rotámericos para cada estructura inicial.

El conjunto de proteínas se genera ejecutando RosettaDesign únicamente en la estructura de la proteína diana. En este caso, se generan 2.000 conformaciones de rotámeros para la estructura inicial única, por lo que el tamaño final del conjunto es de 2.000 estructuras (conjunto F en la Ec. 6).

Proteína WISDOM

Protein WISDOM, que significa Protein Workbench for In Silico De novo design Of bioMolecules, es una herramienta en línea que brinda a la comunidad académica acceso a nuestro marco de diseño de novo de proteínas de forma fácil de usar. Puede abordar varios objetivos de diseño comúnmente encontrados, desde diseñar cadenas proteicas individuales que adopten un pliegue plantilla hasta diseñar péptidos novedosos que se unan a una proteína diana. Las siguientes dos secciones describen las capacidades de Protein WISDOM con respecto a los dos tipos principales de problemas de diseño de proteínas que se presentan. El primer tipo aplica selección de secuencia para elegir secuencias novedosas favorables en la plantilla de diseño dada y luego utiliza especificidad de plegamiento para validar las secuencias novedosas. El segundo tipo utiliza selección de secuencia para elegir secuencias novedosas de un péptido unido en un complejo y luego emplea tanto especificidad de plegamiento como cálculos aproximados de afinidad de unión para validar las secuencias novedosas.

Registro de usuario

Visite la página web de Protein WISDOM en http://www.proteinwisdom.org.

Haga clic en el botón Iniciar sesión de usuario en la parte superior derecha de la página. Haga clic en "Haga clic aquí" para registrarse.

Complete la información relacionada con la dirección de correo electrónico y el nombre de usuario solicitado, y haga clic en continuar.

Complete la información adicional sobre nombre, institución, grupo y dirección. Haga clic en la casilla para aceptar los términos de uso. Haga clic en el botón "Enviar registro".

Primera etapa: Selección de la secuencia

Envío de la secuencia de proteína y estructura(s) plantilla

Haga clic en el botón Inicio de sesión de usuario para comenzar el experimento de diseño de proteínas. Se muestra al usuario su "Página de inicio de usuario" (Figura 3) que incluye el número de trabajos que ha enviado, el número de estructuras (plantillas) que ha cargado y una lista de las estructuras que ha subido hasta ahora.

Inicie un nuevo trabajo de diseño haciendo clic en "Crear nuevo trabajo". El usuario accede a la página de "Envío del trabajo" (Figura 4). Asigne un nombre al trabajo e indique si se basa en un trabajo anterior (es decir, la misma plantilla de diseño, conjuntos de mutaciones y restricciones biológicas pueden importarse a un nuevo trabajo, aunque el usuario tendrá la posibilidad de modificar los conjuntos de mutaciones y las restricciones biológicas). Haga clic en "continuar".

Suba la(s) estructura(s) proteica(s) de la plantilla de diseño (Figura 5). Esta plantilla debe estar en formato estándar del banco de datos de proteínas (PDB). Puede ser una plantilla rígida (un único conjunto de coordenadas para cada átomo) o una plantilla flexible (múltiples modelos, como los obtenidos a partir de estructuras en solución por RMN). En el caso de diseñar una sola proteína, solo puede haber una cadena en la plantilla. El usuario puede subir una nueva plantilla o seleccionar entre plantillas existentes que haya subido previamente. Indique opcionalmente el ID pdb de la plantilla, si está disponible. Si se suben múltiples plantillas, asegúrese de que cada modelo comience con "MODEL #" y termine con "ENDMDL". Asegúrese de que cada residuo esté designado por un aminoácido natural. Haga clic en "Continuar".

Tras la carga exitosa de la plantilla, Protein WISDOM mostrará el número de residuos, cadenas y modelos que encontró en la plantilla, listará la secuencia y pedirá al usuario que verifique la plantilla. Confirme la estructura de la plantilla si se ha introducido correctamente y haga clic en "Continuar".

Una vez que la plantilla se ha cargado y confirmado correctamente, el usuario accede a la "Página de Control Principal" (Figura 6). En esta página, el usuario puede ver el estado del trabajo, modificar los conjuntos de mutaciones y las restricciones biológicas, y enviar el trabajo para la Etapa Uno: Selección de Secuencias. En este momento, dado que la Etapa Uno aún no ha finalizado, no hay opciones disponibles para la Etapa Dos. Estas opciones aparecen una vez que los resultados de la Etapa Uno están disponibles.

Selección de Conjuntos de Mutaciones

Haga clic en el enlace "Conjuntos de mutaciones" en la "Página de control principal" para definir conjuntos de mutaciones.

Seleccione qué residuos podrán mutar y qué aminoácidos podrán adoptar tras la mutación (Figura 7). Por defecto, los aminoácidos permitidos en cualquier posición se seleccionan en función del área de superficie accesible al solvente (SASA). Es obligatorio definir conjuntos de mutaciones.

Haga clic en «Guardar cambios» después de seleccionar los conjuntos de mutaciones. El usuario puede elegir continuar editando el conjunto de mutaciones. Al finalizar la edición del conjunto de mutaciones, haga clic para regresar a la «Página de control principal».

Selección de restricciones biológicas

Haga clic en el enlace «Restricciones biológicas» en la «Página de control principal» para definir las restricciones biológicas.

Especifique restricciones de carga o contenido de aminoácidos en toda la proteína o en una porción de ella (Figura 8).

Limite el número total de mutaciones permitidas, si es necesario. Las restricciones biológicas son opcionales. Haga clic para regresar a la "Página de control principal" cuando termine.

Envío de la Etapa Uno: Selección de la Secuencia

Haga clic en el enlace "Begin Stage 1" para llevar al usuario a la página "Submit Stage 1".

Seleccione la cadena que se desea diseñar (Figura 9), el número de secuencias a generar, el campo de fuerza dependiente de la distancia y el modelo. Si se está diseñando un complejo y se desea realizar un cálculo de especificidad de plegamiento, se debe elegir únicamente una cadena para el diseño. Si la plantilla cargada era una única estructura o una «plantilla rígida», solo se permite el modelo de Estructura Única. Si la plantilla cargada es flexible, el usuario tiene la opción de elegir entre los tres modelos: Estructura Única, Promedio Ponderado y Bin de Distancia. Tenga en cuenta la complejidad computacional de la optimización que se resolverá. Existe un límite superior de 2025 para la complejidad computacional permitida.

Envíe el trabajo. El usuario será redirigido de regreso a la "Página principal de control" (Figura 10). El estado del trabajo se actualizará para indicar el progreso actual del mismo. El trabajo quedará bloqueado para su edición tras el envío.

Una vez finalizado el trabajo, el usuario recibe un correo electrónico con los resultados, que consisten en una lista de secuencias diseñadas. Los resultados también son visibles en la "Página de Control Principal". Aparece en la página un cuadro para la Etapa 2: Especificidad de Plegamiento que permite al usuario realizar esta validación.

Etapa Dos: Cálculos de Especificidad de Plegamiento

Envío de Especificidad de Plegamiento

Haga clic en "Iniciar Etapa 2: Especificidad del plegamiento" para acceder a la página "Construir Etapa 2". Defina los límites superior e inferior de la distancia Cα-Cα especificando el factor de flexibilidad de la plantilla ya sea como un porcentaje de la distancia o como una distancia fija. Defina los límites angulares superior e inferior para los ángulos diedros φ y ψ especificando el factor de flexibilidad de la plantilla como un porcentaje. Tenga en cuenta que, al utilizar una plantilla flexible, los límites superior e inferior de distancia se toman como los valores de distancia más bajos y más altos entre todos los modelos de la plantilla. De manera similar, los límites angulares superior e inferior se obtienen de los valores angulares más altos y más bajos entre todos los modelos.

Haga clic en el botón "Submit".

Especifique el número de estructuras por secuencia que se generarán y haga clic en "Continuar". Tenga en cuenta que existe un límite superior de 500 estructuras por secuencia que se pueden generar.

Haga clic en "Continue" para confirmar la intención de enviar a validación de plegamiento. La Etapa Uno y la Etapa Dos quedan bloqueadas para su edición hasta la finalización de la Etapa Dos.

Una vez finalizado el trabajo, se envía un correo electrónico al usuario con los resultados. Consulte los resultados en Protein WISDOM en la "Página de Control Principal" (Figura 11). Aquí se pueden ver y descargar los archivos de texto que contienen las secuencias diseñadas, los valores de energía correspondientes de la Etapa Uno y los valores de especificidad de plegamiento de la Etapa Dos. Además, el usuario puede hacer clic en el enlace "Ver Resultados", que muestra una tabla en el navegador con los rangos y valores de energía de la Etapa Uno, así como los rangos y valores de especificidad de plegamiento de la Etapa Dos.

Tercera etapa: Cálculos aproximados de la afinidad de unión para complejos proteína-péptido

Los cálculos de afinidad de unión aproximada determinan la afinidad de la proteína o péptido ligando diseñado respecto al resto del complejo. Estos cálculos pueden realizarse directamente después de la Etapa Uno, o tras completar los cálculos de especificidad de plegamiento.

Haga clic en "Secuencia #" para seleccionar la secuencia con la que comenzar el cálculo aproximado de la afinidad de unión. El usuario será dirigido a la página "Seleccionar secuencia", que presenta una lista de las secuencias diseñadas junto con sus rangos de selección de secuencia y especificidad de plegamiento. Solo se puede seleccionar una secuencia a la vez para el cálculo aproximado de la afinidad de unión, ya que los cálculos son muy exigentes computacionalmente. Tras completar una secuencia, el usuario puede seleccionar otra secuencia para calcular su afinidad de unión aproximada, y este resultado se añade al resultado anterior, mostrando la afinidad de unión aproximada para todas las secuencias completadas. Una vez que se selecciona y guarda una secuencia, el usuario es redirigido a la "Página principal de control".

Haga clic en "Iniciar Etapa 2: Afinidad de unión aproximada" para enviar el trabajo. Al completarse, los resultados se envían por correo electrónico al usuario, incluyendo un archivo adjunto con el número de secuencia, la afinidad de unión aproximada y los valores de las funciones de partición en la Ecuación 6. Para cada trabajo subsiguiente de afinidad de unión aproximada, este archivo contiene los resultados de todas las secuencias completadas. Los resultados completos (desde la selección de secuencias, especificidad de plegamiento y afinidad de unión aproximada) también pueden consultarse accediendo a la "Página de control principal" del trabajo (Figura 12).

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Resultados

Diseño De Novo de Inhibidores de Entrada para el VIH-1

El marco de diseño de novo implementado en Protein WISDOM se ha utilizado para el diseño de péptidos inhibidores en varios sistemas terapéuticos importantes (Tablas 1 y 2). Un sistema destacado es el diseño de péptidos para inhibir la entrada del VIH-1 al receptor celular huésped CD4, que aquí se utiliza como un sistema representativo para demostrar el uso práctico de la interfaz de Protein WISDOM. Los pépti...

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Discusión

El marco de diseño de proteínas de novo consta de dos etapas, una etapa de selección de secuencia y una etapa de validación. El marco es lo suficientemente robusto como para manejar plantillas de diseño rígidas y flexibles, y se puede aplicar al diseño de una sola proteína o al diseño de proteínas complejas. El marco se ha aplicado con éxito a numerosos sistemas de proteínas con aplicaciones a docenas de enfermedades. Varios de los diseños han sido validados experimentalmente, proporcionando los inhibidores o ag...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

CAF agradece el apoyo de NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736), y la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU., EPAA (R 832721-010). Una parte de esta investigación fue posible gracias al apoyo gubernamental de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea del Departamento de Defensa. JS agradece el apoyo de los NIH (P50GM071508-06). MLBP agradece el apoyo de una beca de posgrado en ciencia e ingeniería de defensa nacional (NDSEG), 32 CFR 168a. GAK agradece el apoyo de una beca de investigación de posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención DGE-1148900.

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Referencias

  1. Drexler, K. Molecular engineering: An approach to the development of general capabilities for molecular manipulation. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 78, 5275-5278 (1981).
  2. Pabo, C. Molecular technology: Designing proteins and peptides. Nature. 301, 200(1983).
  3. Floudas, C. A. Research challenges, opportunities and synergism in systems engineering and computational biology. AIChE J. 51, 1872-1884 (2005).
  4. Fung, H. K., Welsh, W. J., Floudas, C. A. Computational de novo peptide and protein design: Rigid templates versus flexible templates. Ind. Eng. Chem. Res. 47, 993-1001 (2008).
  5. Ponder, J., Richards, F. Tertiary templates for proteins. J. Mol. Biol. 193, 775-791 (1987).
  6. Dahiyat, B. I., Mayo, S. L. Protein design automation. Protein Sci. 5, 895-903 (1996).
  7. Dahiyat, B. I., Gordon, D. B., Mayo, S. L. Automated design of the surface positions of protein helices. Protein Sci. 6, 1333-1337 (1997).
  8. Su, A., Mayo, S. L. Coupling backbone flexibility and amino acid sequence selection in protein design. Protein Sci. 6, 1701-1707 (1997).
  9. Desjarlais, J., Handel, T. Side chain and backbone flexibility in protein core design. J. Mol. Biol. 290, 305-318 (1999).
  10. Farinas, E., Regan, L. The de novo design of a rubredoxin-like Fe site. Protein Sci. 7, 1939-1946 (1998).
  11. Harbury, P. B., Plecs, J. J., Tidor, B., Alber, T., Kim, P. S. High-resolution protein design with backbone freedom. Science. 282, 1462-1467 (1998).
  12. Koehl, P., Levitt, M. De novo protein design: I. In search of stability and specificity. J. Mol. Biol. 293, 1161-1181 (1999).
  13. Koehl, P., Levitt, M. De novo protein design. II. Plasticity in sequence space. J. Mol. Biol. 293, 1183-1193 (1999).
  14. Kuhlman, B., Dantae, G., Ireton, G., Verani, G., Stoddard, B., Baker, D. Design of a novel globular protein fold with atomic-level accuracy. Science. 302, 1364-1368 (2003).
  15. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Integrated structural, computational and experimental approach for lead optimization: Design of compstatin variants with improved activity. J. Am. Chem. Soc. 125, 8422-8423 (2003).
  16. Klepeis, J. L., Floudas, C. A., Morikis, D., Tsokos, C. G., Lambris, J. D. Design of peptide analogs with improved activity using a novel de novo protein design approach. Ind. Eng. Chem. Res. 43, 3817-3826 (2004).
  17. Fung, H. K., Floudas, C. A., Taylor, M. S., Zhang, L., Morikis, D. Toward full-sequence de novo protein design with flexible templates for human beta-defensin-2. Biophys. J. 94, 584-599 (2008).
  18. Bellows, M. L., Fung, H. K., Floudas, C. A., López de Victoria, A., Morikis, D. New compstatin variants through two de novo protein design frameworks. Biophys. J. 98, 2337-2346 (2010).
  19. López de Victoria, A., Gorham, R. D. Jr A new generation of potent complement inhibitors of the compstatin family. Chem. Biol. Drug Des. 77, 431-440 (2011).
  20. Tamamis, P., López de Victoria, A. Molecular dynamics in drug design: New generations of compstatin analogs. Chem. Biol. Drug Des. 79, 703-718 (2012).
  21. Bellows-Peterson, M. L., Fung, H. K. De novo peptide design with c3a receptor agonist and antagonist activities: Theoretical predictions and experimental validation. J. Med. Chem. 55, 4159-4168 (2012).
  22. Bellows, M. L., Taylor, M. S. Discovery of entry inhibitors for HIV-1 via a new de novo protein design framework. Biophys. J. 99, 3445-3453 (2010).
  23. Sun, J. -J., Abdeljabbar, D. M., Clarke, N. L., Bellows, M. L., Floudas, C. A., Link, A. J. Reconstitution and engineering of apoptotic protein interactions on the bacterial cell surface. J. Mol. Biol. 394, 297-305 (2009).
  24. Smadbeck, J., Bellows-Peterson, M. L. De novo protein design and validation of histone methyltranferase inhibitors. , In Preparation (2013).
  25. Bellows, M. L., Fung, H. K., Floudas, C. A. Molecular Systems Engineering, Process Systems Engineering. Adjiman, C. S., Galindo, A. 6, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 207-232 (2010).
  26. Rajgaria, R., McAllister, S. R., Floudas, C. A. A novel high resolution Cα-Cα distance dependent force field based on a high quality decoy set. Proteins. 65, 726-741 (2006).
  27. Rajgaria, R., McAllister, S. R., Floudas, C. A. Distance dependent centroid to centroid force fields using high resolution decoys. Proteins. 70, 950-970 (2008).
  28. Fung, H. K., Taylor, M. S., Floudas, C. A. Novel formulations for the sequence selection problem in de novo protein design with flexible templates. Optim. Method. Softw. 22, 51-71 (2007).
  29. Fung, H. K., Rao, S., Floudas, C. A., Prokopyev, O., Pardalos, P. M., Rendl, F. Computational comparison studies of quadratic assignment like formulations for the in silico sequence selection problem in de novo protein design. J. Comb. Optim. 10, 41-60 (2005).
  30. CPLEX. Using the CPLEX Callable Library. , ILOG, Inc. (1997).
  31. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Free energy calculations for peptides via deterministic global optimization. J. Chem. Phys. 110, 7491-7512 (1999).
  32. Klepeis, J. L., Floudas, C. A., Morikis, D., Lambris, J. D. Predicting peptide structures using NMR data and deterministic global optimization. J. Comput. Chem. 20, 1354-1370 (1999).
  33. Klepeis, J. L., Schafroth, H. D., Westerberg, K. M., Floudas, C. A. Deterministic global optimization and ab initio approaches for the structure prediction of polypeptides, dynamics of protein folding and protein-protein interactions. Adv. Chem. Phys. 120, 265-457 (2002).
  34. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Ab initio prediction of helical segments of polypeptides. J. Comput. Chem. 23, 246-266 (2002).
  35. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Prediction of beta-sheet topology and disulfide bridges in polypeptides. J. Comput. Chem. 24, 191-208 (2003).
  36. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. ASTRO-FOLD: A combinatorial and global optimization framework for ab initio prediction of three-dimensional structures of proteins from the amino acid sequence. Biophys. J. 85, 2119-2146 (2003).
  37. Klepeis, J. L., Pieja, M. T., Floudas, C. A. A new class of hybrid global optimization algorithms for peptide structure prediction: Integrated hybrids. Comput. Phys. Commun. 151, 121-140 (2003).
  38. Klepeis, J., Pieja, M., Floudas, C. Hybrid global optimization algorithms for protein structure prediction : Alternating hybrids. Biophys. J. 84, 869-882 (2003).
  39. Klepeis, J. L., Floudas, C. Analysis and prediction of loop segments in protein structures. Comput. Chem. Eng. 29, 423-436 (2005).
  40. Mo¨nnigmann, M., Floudas, C. Protein loop structure prediction with flexible stem geometries. Proteins. 61, 748-762 (2005).
  41. McAllister, S. R., Mickus, B. E., Klepeis, J. L., Floudas, C. A. A novel approach for alpha-helical topology prediction in globular proteins: Generation of interhelical restraints. Proteins. 65, 930-952 (2006).
  42. Floudas, C. A., Fung, H. K., McAllister, S. R., Mönnigmann, M., Rajgaria, R. Advances in protein structure prediction and de novo protein design: A review. Chem. Eng. Sci. 61, 966-988 (2006).
  43. Subramani, A., Wei, Y., Floudas, C. A. ASTRO-FOLD 2.0: An enhanced framework for protein structure prediction. AIChE J. 58, 1619-1637 (2012).
  44. Wei, Y., Thompson, J., Floudas, C. Concord: a consensus method for protein secondary structure prediction via mixed integer linear optimization. P. Roy. Soc. A-Math. Phy. 468, 831-850 (2011).
  45. Subramani, A., Floudas, C. β-sheet topology prediction with high precision and recall for β and mixed α/β proteins. PLoS One. 7, e32461(2012).
  46. Rajgaria, R., Wei, Y., Floudas, C. A. Contact prediction for beta and alpha-beta proteins using integer linear optimization and its impact on the first principles 3D structure prediction method ASTRO-FOLD. Proteins. 78, 1825-1846 (2010).
  47. Subramani, A., Floudas, C. A. Structure prediction of loops with fixed and flexible stems. J. Phys. Chem. B. 116, 6670-6682 (2012).
  48. Güntert, P., Mumenthaler, C., Wüthrich, K. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA. J. Mol. Biol. 273, 283-298 (1997).
  49. Güntert, P. Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol. Biol. 278, 353-378 (2004).
  50. Ponder, J. TINKER, software tools for molecular design. , Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine. Louis, MO. (1998).
  51. Cornell, W. D., Cieplak, P. A 2nd generation forcefield for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules. J. Am. Chem. Soc. 117, 5179-5197 (1995).
  52. Lilien, R. H., Stevens, B. W., Anderson, A. C., Donald, B. R. A novel ensemble-based scoring and search algorithm for protein redesign and its application to modify the substrate specificity of the gramicidin synthetase a phenylalanine adenylation enzyme. J. Comput. Biol. 12, 740-761 (2005).
  53. Lee, M. R., Baker, D., Kollman, P. A. 2.1 and 1.8 A°Cα RMSD structure predictions on two small proteins, HP-36 and S15. J. Am. Chem. Soc. 123, 1040-1046 (2001).
  54. Rohl, C. A., Baker, D. De novo determination of protein backbone structure from residual dipolar couplings using rosetta. J. Am. Chem. Soc. 124, 2723-2729 (2002).
  55. Rohl, C. A., Strauss, C. E. M., Misura, K. M. S., Baker, D. Protein structure prediction using rosetta. Methods Enzymol. 383, 66-93 (2004).
  56. DiMaggio, P. A., McAllister, S. R., Floudas, C. A., Feng, X. J., Rabinowitz, J. D., Rabitz, H. A. Biclustering via optimal re-ordering of data matrices in systems biology: Rigorous methods and comparative studies. BMC Bioinformatics. 9 (458), (2008).
  57. DiMaggio, P. A., McAllister, S. R., Floudas, C. A., Feng, X. J., Rabinowitz, J. D., Rabitz, H. A. A network flow model for biclustering via optimal re-ordering of data matrices. J Global Optimization. 47, 343-354 (2010).
  58. Daily, M. D., Masica, D., Sivasubramanian, A., Somarouthu, S., Gray, J. J. CAPRI rounds 3-5 reveal promising successes and future challenges for RosettaDock. Proteins. 60, 181-186 (2005).
  59. Gray, J. J., Moughon, S., et al. Protein-protein docking with simultaneous optimization of rigid-body displacement and side-chain conformations. J. Mol. Biol. 331, 281-299 (2003).
  60. Gray, J. J., Moughon, S. E., et al. Protein-protein docking predictions for the CAPRI experiment. Proteins. 52, 118-122 (2003).
  61. Kuhlman, B., Baker, D. Native protein sequences are close to optimal for their structures. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 97, 10383-10388 (2000).
  62. Jmol: an open-source java viewer for chemical structures in 3d. , Available from: http://www.jmol.org (2013).

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