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1. La expansión de los NPCs Humanos (Figura 1)
- Revive la madre congelada de NPCs humanos de cerebro fetal (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) y el cultivo en suspensión en matraces T-75 como neuroesferas (Figura 1A) en medio neurobasal contienen suplementos proliferación, EGF (10 ng / ml) y FGF (10 ng / ml).
- Después de 3 días en cultivo, transferir las neuroesferas a un tubo de 15 ml y centrifugar a 500 rpm durante 5 min.
- Descartar el sobrenadante dejando tras de ~ 100 l medio por encima de la pastilla de células y transferir a un tubo Eppendorf. Un pelet de 100 l de células es suficiente para dividir en 2 matraces T-75. Si menos, reducir el número de frascos como células neuroprogenitoras fallan a proliferar si dividir delgada.
- Se tritura el precipitado con una punta l 50x 200 mientras se mantiene la punta 200 l contra la parte inferior del tubo. Divida la suspensión de células por igual en dos partes y añadirlos a 2 T-75 frascos (1-2), una división de continuarla expansión y la otra para la diferenciación.
- Continuar con el cultivo de las células neuroprogenitoras de expansión (primer matraz) cambiando el medio cada 4-5 días hasta que las neuroesferas alcanzan su tamaño original de 300-500 micras. Cambie medio por centrifugación (500 rpm, 5 min), se elimina el medio viejo y añadir nuevo medio.
2. La diferenciación de los NPCs humano en una cultura de la neurona-rica (Figura 2)
- Para la diferenciación de las células neuroprogenitoras en una rica cultura de la neurona, coloque un solo cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cubrir con 100 g / ml de poli-L-lisina mediante la adición de 500 l en cada pocillo. Incubar los platos durante 30 min a TA.
- Aspirar la solución de poli-L-lisina y enjuagar la placa con agua estéril.
- Después, cubra los pocillos de la placa con 500 l de 5 mg / ml de laminina de ratón y se incuba durante 30 min. Después de la incubación, lavar los pocillos con PBS.
- 4 días después splittión de las células (paso 1.4), transfiera las pequeñas neuroesferas en el frasco etiquetado «para la diferenciación 'en las placas revestidas con una densidad de ~ 500 neuroesferas por pocillo de placas de 24 pocillos.
- Después de 6 horas, cuando las neuroesferas se fijan a la placa, retire el medio de proliferación y se añade medio de diferenciación consiste en medio neurobasal, suplemento de B27, NGF (20 ng / ml), el BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), y ácido retinoico (2 M).
3. Inmunofluorescencia tinción de Diferenciados NPCs (Figura 3)
- Después del cultivo de las células neuroprogenitoras en medio de diferenciación neuronal durante dos semanas, se obtiene un cultivo de neuronas-rica. Enjuague las neuronas una vez en PBS y luego fijar en paraformaldehído al 4% durante 30 min. Una vez fijado, enjuagar las células tres veces con PBS.
- Se incuban las células con tampón de permeabilización (5% de BSA y 0,2% de Triton X-100 en PBS) a TA durante 60 min.
- Incubar los platos O / N a 4 ° C iagitador de NA con la siguiente combinación de anticuerpos policlonales y monoclonales en 3% de BSA en PBS: NeuN (1:250) y sinapsina (1:250); acetil colinesterasa (1:500) y sinaptofisina (1:250); BDNF (1 : 500) y GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) y GFAP (1:1000).
- Lavar los cubreobjetos tres veces con PBS y luego se incuban con anticuerpos secundarios anti-ratón-FITC anti-conejo-Cy3 y a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 min. Después de la incubación, los cubreobjetos lavar tres veces con PBS.
- Ponga 10 l de medio de montaje sobre un portaobjetos de vidrio, sacar el portaobjetos de la placa de cultivo con unas pinzas y colóquela boca abajo en el medio de montaje. Con cuidado, limpie el exceso de medio de montaje y sellar los bordes con esmalte de uñas.
- Examine las neuronas inmunoteñidas en un microscopio de fluorescencia.
4. Microdisección de captura por láser de neuronas (Figura 4)
- Diferenciar NPCs en un cultivo de neuronas ricas en PEN diapositiva membranas recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón siguiendo los procedimientos descritos para la Figura 2.
- Realice todos los pasos subsiguientes en condiciones libres de RNasa.
- Teñir las culturas utilizando HistoGene Stain (Arcturus) para visualizar las células.
- Encuentra las áreas de poblaciones neuronales puras carentes de astrocitos utilizando la imagen del mapa de carreteras de toda la diapositiva con el sistema Veritas LCM. Marque las neuronas usando las herramientas de dibujo.
- Realizar captura por láser de estas áreas utilizando precisión y la automatización controlada por ordenador en un proceso de dos pasos. En primer lugar, de IR (infrarrojos) se enciende en múltiples puntos con un ajuste de potencia de láser de 70 mW y un pulso de 2500 microsegundos para obtener la membrana se adhieren a la tapa. A continuación, el área marcada se extirpa mediante una herramienta de corte de UV en un ajuste bajo nivel de 10 mV.
- La combinación de estos procesos de captura selectivamente las zonas marcadas de la membrana PEN en CapSure LCM macro tapas. Cuando se levanta la tapa, la membrana con el neurons se adhiere a la tapa.
- Aislar ARN total de muestras LCM utilizando un kit de aislamiento de ARN PicoPure (Arcturus) y tratar con DNasa.
- Amplificar el ARN aislado utilizando el kit de amplificación RiboAmp ARN siguiendo instrucciones del kit.
- Realizar Análisis en tiempo real RT-PCR utilizando sondas TaqMan para detectar neurofilamento humana de cadena pesada (hNFHc).
Abreviaturas:
AD, la enfermedad de Alzheimer; BDNF, el factor neurotrófico derivado del cerebro; CREB, la proteína de unión al elemento de respuesta al AMP cíclico; DBC, el AMP cíclico dibutiril; EGF, factor de crecimiento epidérmico; FGF, factor de crecimiento de fibroblastos; GFAP, proteína ácida glial fibrilar; LCM, laser capturar microdissection; NGF, factor de crecimiento nervioso; NPC, neuroprogenitoras celular; PEN, polietilennaftalato.