Tripsina Protocolo Resumen Para analizar la vasculatura de la retina de un modelo de ratón

Resumen

Digestión con tripsina es uno de los métodos más comúnmente utilizados para analizar vasculatura de la retina. Este manuscrito describe el método en detalle, incluyendo alteraciones clave para optimizar la técnica y eliminar el tejido no vascular, mientras que la preservación de la arquitectura general de los vasos.

Resumen

Digestión con tripsina es el método estándar de oro para analizar la vasculatura de la retina ^1-5. Se permite la visualización de la totalidad de la red de vasos complejas tridimensionales retina y capilares sanguíneos mediante la creación de un plano de montaje en dos dimensiones de los canales vasculares interconectados después de la digestión de los componentes no-vasculares de la retina. Esto permite estudiar varios cambios patológicos vasculares, tales como microaneurismas, degeneración capilar, y anormal endoteliales a las relaciones de pericitos. Sin embargo, el método es técnicamente difícil, especialmente en los ratones, que se han convertido en el modelo animal más ampliamente disponible para estudiar la retina debido a la facilidad de manipulaciones genéticas ^6,7. En el ojo del ratón, que es particularmente difícil de eliminar por completo los componentes no vasculares, mientras que el mantenimiento de la arquitectura general de los vasos sanguíneos de la retina. Hasta la fecha, hay una escasez de literatura que describe la técnica de digestión con tripsina en detalle in el ratón. Este manuscrito ofrece una metodología detallada de la digestión con tripsina en la retina del ratón, paso a paso, mientras que también proporciona consejos para la solución de problemas difíciles pasos.

Introducción

Visualización de la vasculatura de la retina es un enfoque extremadamente importante para diseccionar los mecanismos de diversas enfermedades oculares tales como retinopatía diabética. Esto permite evaluar las anormalidades vasculares tempranas, como microaneurismas, degeneración capilar, y la pérdida de pericitos ^8,9. Hasta la fecha, se han realizado varias técnicas desarrolladas para analizar la vasculatura de la retina. La perfusión de varios tintes se ha utilizado para resaltar los vasos, pero todos han compartido las mismas limitaciones. Inyección rara vez se pone de relieve toda la vasculatura de la retina a menos dado a una alta presión, lo que corr....

Protocolo

1. Preparación de retina

1. Enucleación del ojo del ratón. Uso de un lado, abrir las tapas del ojo para que el ojo es visible. Con la otra mano, usando unas pinzas curvas (curvas mirando hacia arriba), aplique presión en los aspectos superior e inferior de la órbita hasta que sobresalga el globo. Cierre suavemente fórceps en el aspecto posterior del ojo y levantar en un movimiento continuo a enucleación del ojo.
2. Fijar ojo con 10% formalina tamponada neutra durante al menos 24 horas.
3. Lugar ojo en una solución de PBS en una placa de Petri pequeña.
4. Diseccionar retina cuidadosamente bajo un microscopio, teniendo cuidado de evitar la ....

Resultados

El producto final de un procedimiento exitoso es un montaje plana de toda la red de la vasculatura de la retina del ratón, con la arquitectura mantiene, se tiñeron con cualquiera de PAS / hematoxilina o H & E, como se muestra en las Figuras 2-4. Claro diferenciación de las células endoteliales y los pericitos se puede ver como se muestra en la Figura 3. En la retina, los núcleos de las células endoteliales son oval o alargada y situada completamente dentro de la pared del vaso. Peri.......

Discusión

Digestión con tripsina es un método estándar para evaluar la vasculatura de la retina. Por desgracia, es técnicamente difícil y puede dar lugar a alta tasa de pérdida de muestra si no se realiza correctamente. Además, el procedimiento es especialmente difícil en ratones, lo cual puede limitar la aplicación de esta técnica en los modelos animales genéticos comúnmente utilizados de enfermedades de los ojos. Este documento proporciona una guía sobre cómo llevar a cabo con eficacia y coherencia del procedimiento en los ojos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
REACTIVOS
10% formalina tamponada neutra	Fischer Scientific	SF100-4
Tripsina (1:250)	Amresco	0458-50G	Hacer tripsina al 3% en 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Cree 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 ° C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Botella de vacío estéril Steritop	Millipore	SCGPS05RE	Crear agua
EQUIPMENT
Microscopio			Cualquier microscopio que permita una buena visualización de la retina es adecuado. (10x es suficiente con una distancia de trabajo de 24 mm)
Tijeras rectas	Fine Science Tools	15024-10	Filo de corte: 8 mm; Diámetro de la punta: 0,2 mm;
(Inox)	Dumont #5	11252-20	Punta Biologie; 0,05 x 0,02 mm; 11 cm
Forcepts curvos (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Punta Biologie; 0,07 x 0,04 mm; 11,5 cm
Incubadora Batidora Metabólica Dubnoff	Precision Scientific	BDG59442	Shaker opcional
Plato de 24 pocillos	Portaobjetos de
	VWR	82027-132

filtrada de disección Pinza recta de 10 cm microscopio Falcon 353047