Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

Resumen

Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.

Resumen

Las células humanas no proliferan indefinidamente. Al señales externas y / o intrínsecos, las células pueden morir o introduzca un detención del ciclo celular estable llamado senescencia. Varios mecanismos celulares, tales como el acortamiento de los telómeros y la expresión anormal de oncogenes mitógenos, se ha demostrado que causa la senescencia. La senescencia no está restringida a las células normales, las células cancerosas también se ha informado de senescencia.

Fármacos quimioterapéuticos han demostrado inducir la senescencia en células de cáncer. Sin embargo, hay controversia sobre la senescencia previene o promueve la tumorigénesis. Como el tiempo podría ser específica del paciente, un método rápido y sensible para evaluar la senescencia en células de cáncer pronto será necesaria.

Para este fin, el ensayo de β-galactosidasa estándar, el método utilizado actualmente, presenta importantes inconvenientes: es mucho tiempo y no es sensible. Se propone aquí un ensayo de citometría de flujo basada en la senescencia de estudiar en liVE células. Este ensayo ofrece la ventaja de ser rápido, sensible, y puede ser acoplado a la inmunomarcación de diversos marcadores celulares.

Introducción

Desde principios de los años sesenta y su descubrimiento por Hayflick y Moorhead, senescencia sigue siendo una curiosidad celular ^1. Las células humanas no proliferan indefinidamente y, por senescencia, Hayflick y Moorhead acuñaron el proceso celular de envejecimiento. La senescencia es una detención del ciclo celular estable en el que las células permanecen metabólicamente activa en oposición a la muerte celular. Hasta la fecha, cuatro mecanismos celulares se han mostrado para inducir la senescencia: acortamiento de los telómeros, daño en el ADN, perturbación de la cromatina, y la expresión anormal de oncogenes mitógenos ^2. Esto indica que no sólo las células normales, pero también las células cancerosas son capaces de someterse a la senescencia ^3. Como cuestión de hecho, las células de cáncer sometidos a la senescencia, se mostró a constituir una barrera para la progresión del tumor ^4-5. Sin embargo, varios informes han señalado que, en determinadas circunstancias, la senescencia celular también puede promover la malignidad ^6-7. El estudio de la senescencia de cáncer cells está a punto de convertirse en un impulso en la investigación del cáncer tal como se utilizan actualmente los fármacos quimioterapéuticos pueden conducir a la senescencia de las células cancerosas no sólo in vitro sino también in vivo ^8.

El ensayo principal para investigar la presencia de células senescentes es el ensayo de β-galactosidasa a pH ácido. Este ensayo histoquímico refleja el aumento en la biogénesis lisosomal que ocurre en la mayoría de las células senescentes. Brevemente, exógeno X-gal, aplicada a las células, se escinde por la β-galactosidasa enriquecido en los lisosomas de las células senescentes, dando lugar a un color azul ^9. Las células senescentes azules a continuación, pueden ser cuantificados con un microscopio de campo brillante. Aunque es muy popular, el ensayo de β-galactosidasa presenta mayores inconvenientes. En primer lugar, este ensayo se lleva a cabo en células fijadas. En segundo lugar, es mucho tiempo, ya que es necesario cuantificar el grado de senescencia contando un número significativamente alto de células senescentes bajo un microscopio. En tercer lugar, este ensayono es sensible como la discriminación entre las células senescentes y no senescentes se basa enteramente en el observador.

Se discuten aquí un ensayo de citometría basada sin explotar, rápida y sensible para evaluar la presencia de células senescentes en vivo. Este ensayo se basa en la hidrólisis de una molécula de membrana permeable, la 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopiranósido (C ₁₂ FDG), por β-galactosidasa enriquecida en células senescentes. Después de la hidrólisis y de excitación láser, el C ₁₂ FDG emite fluorescencia verde y por lo tanto puede ser detectada por citometría de flujo ^{10, 11.} La detección de las células senescentes a través de citometría de flujo ofrece la gran ventaja de ser rápido y sensible. Además, la detección de las células senescentes por citometría de flujo se puede acoplar con la detección de otros marcadores celulares. Este ensayo se puede usar para detectar las células senescentes dentro de una población de células cancerosas tratadas con quimioterapia y se puede ajustar de forma rutinariaarriba en secciones de tejido, después de la disociación celular, en la clínica.

Protocolo

1. Preparación de C12FDG, bafilomicina A1, y cultivo celular

1. Disolver el polvo de C ₁₂ FDG en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración final de 20 mM. Alícuota y almacenar a -20 ° C. DMSO se debe utilizar con las condiciones de seguridad adecuadas.
2. Disolver el polvo de bafilomicina A1 en DMSO a una concentración final de 0,1 mM. Alícuota y almacenar a - 20 ° C. Bafilomicina se debe utilizar con las condiciones de seguridad adecuadas.
3. Cultivar línea de medio RPMI 8226 celular, u otras líneas celulares adherentes o no, en medios que contienen 10% de suero fetal bovino y 1% de antibióticos, a 37 ° C, 5% de CO _2. Calcular el número de células necesarias para el experimento. Con el fin de grabar un número suficiente de eventos durante el análisis de citometría de flujo, se requieren células de 5 x 10 ^5. Para determinar el porcentaje de células senescentes, se requieren tres muestras de células: muestra sin etiqueta, las células no tratadas teñidas con C ₁₂ FDG, las células tratadas se tiñeron conC ₁₂ FDG.
4. Semilla de la células 24 horas antes de realizar el experimento para que las células se encuentran en la fase logarítmica de la curva de la proliferación celular.

2. La inducción de la senescencia

1. Inducir la senescencia de las células cancerosas mediante la adición de un fármaco quimioterapéutico. La concentración de fármaco y la duración del tratamiento deben ser adaptadas al tipo celular probado. Comenzar con un tratamiento de 48 horas a la concentración final de 50 nM doxorrubicina para una concentración de células en alrededor de 10 ⁶ células / ml. No se olvide de incluir la muestra sin tratar (control negativo).

3. Bafilomicina A1 Tratamiento

1. Comprobar la viabilidad celular por las células de mezcla con azul de tripano (v / v), como el fármaco quimioterapéutico usado en el paso anterior podría conducir a la apoptosis de las células. Se envasa en una cámara de Malassez y contar el número de células azules (células muertas) y de glóbulos blancos (células vivas). Si el porcentaje de viabilidad es de menos de 70%, las células muertas pueden ser realesoved utilizando un kit adecuado para garantizar que las células muertas no sesga el análisis posterior.
2. Retire el medio de cultivo y reemplazarlo por el medio de cultivo fresco precalentado. Se tratan las células con una concentración final de 100 nM de bafilomicina A1. Bafilomicina A1 se utiliza para neutralizar el pH ácido de los lisosomas. Incubar 1 hora a 37 ° C, 5% de CO _2.

4. C ₁₂ FDG tinción

1. Disolver C ₁₂ FDG en el medio de cultivo fresco precalentado a una concentración final de 2 mM.
2. Añadir el compuesto a las células a una concentración final de 33 mM y se incuba 2 horas a 37 ° C, 5% de CO _2. Si el uso de las células no adherentes, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C (la velocidad podría tener que ser ajustado para el tipo de célula utilizada), se lava 2 veces con PBS. Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS frío. Si el uso de células adherentes, retire el papel y lavar 2 veces con PBS. Recoger las células adherentes utilizando una solución de tripsina y se centrifugalas células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C (la velocidad podría tener que ser ajustado para el tipo de célula utilizado). Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS frío. En ambos casos, la concentración celular debe ser de aproximadamente 10 ⁶ células / ml.
3. Realizar un co-inmunomarcaje para caracterizar aún más la población de células senescentes.

5. Análisis de citometría de flujo

1. Calibrar el citómetro de flujo utilizando las bolas de control recomendadas por el fabricante del citómetro de flujo. Para todas las medidas, por lo menos 10 ⁴ eventos tienen que ser registrados.
2. Ejecute la primera muestra que contiene células no marcadas. Prepare una visualización Canal dispersión frontal de dos parámetros gráficos (FSC) frente a Canal dispersión lateral (SSC). Ajuste los tubos fotomultiplicadores (PMT) y definir una región de interés excluyendo las células muertas y los desechos celulares que podrían haber aparecido durante la preparación de la muestra. Puerta de esta región de interés en un histograma de un parámetro FL1 mostrar en la escala logarítmicadel eje de las x y el número de eventos en el eje y. El número total de eventos representa el número de células analizadas. Ajuste el PMT para que las células no marcadas aparecen en la primera década en la escala logarítmica de el eje x. Determinar la autofluorescencia de las células si es necesario.
3. Ejecutar la segunda muestra que contiene células no tratadas. En el histograma de un parámetro que muestra FL1 (fluorescencia de C ₁₂ FDG), coloque el cursor después de la población con poca etiqueta. Este límite permitirá discriminación entre células no senescentes (células débilmente marcadas) y las células senescentes (células intensamente marcadas).
4. Ejecute la tercera muestra que contiene células tratadas. Con mucha células marcadas, es decir, células senescentes aparecen por encima del umbral determinado en el paso anterior. Evaluar el porcentaje de células senescentes dividiendo el número de eventos brillantes por el número total de eventos. Si es necesario, la actividad de la β-galactosidasa también se puede estimar usando la media de fluorescenciaintensidad.

Resultados

Mieloma múltiple, un tumor maligno hematológico, se utilizó para evaluar la senescencia inducida por un procedimiento quimioterapéutico. Para ello una línea de células MM disponible en el mercado (RPMI 8226) fue tratado durante 2 días con doxorrubicina, un medicamento quimioterapéutico. Las células se sometieron luego a tratamiento bafilomicina A1 y ​​se incubaron adicionalmente con C ₁₂ FDG. Las células se analizaron por citometría de flujo. Figura 1 ilustra los diferentes pasos y muestra qu...

Discusión

Presentamos aquí un método basado en citometría de flujo para cuantificar la senescencia celular en las células cancerosas vivas. Este método se basa en el uso del compuesto permeable a la membrana, el C ₁₂ FDG, y por lo tanto se puede utilizar en cualquier tipo de células y después de varios tratamientos, siempre y cuando el compuesto es absorbido por las células. Tras la captación celular, el C ₁₂ FDG es hidrolizado por la β-galactosidasa, enriquecido en los lisosomas de las células senescentes. ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-dodecanoilaminofluoresceína di-β-D-galactopiranósido	Invitrogen	D-2893
Dimetilsulfóxido Sigma		D2650
Bafilomicicina A1	Sigma	B1793
Doxorrubicina	Sandoz
Azul de tripán	Sigma	T8154
RPMI 1640 medio de cultivo celular	Lonza	BE12-702
Suero fetal de ternera PAA	Laboratories GmBH	A15 101
Antibióticos	Gibco	5290-018
Citómetro de flujo Gallios	Beckman Coulter	A94291