Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

Resumen

Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.

Resumen

Las células humanas no proliferan indefinidamente. Al señales externas y / o intrínsecos, las células pueden morir o introduzca un detención del ciclo celular estable llamado senescencia. Varios mecanismos celulares, tales como el acortamiento de los telómeros y la expresión anormal de oncogenes mitógenos, se ha demostrado que causa la senescencia. La senescencia no está restringida a las células normales, las células cancerosas también se ha informado de senescencia.

Fármacos quimioterapéuticos han demostrado inducir la senescencia en células de cáncer. Sin embargo, hay controversia sobre la senescencia previene o promueve la tumorigénesis. Como el tiempo podría ser específica del paciente, un método rápido y sensible para evaluar la senescencia en células de cáncer pronto será necesaria.

Para este fin, el ensayo de β-galactosidasa estándar, el método utilizado actualmente, presenta importantes inconvenientes: es mucho tiempo y no es sensible. Se propone aquí un ensayo de citometría de flujo basada en la senescencia de estudiar en liVE células. Este ensayo ofrece la ventaja de ser rápido, sensible, y puede ser acoplado a la inmunomarcación de diversos marcadores celulares.

Introducción

Desde principios de los años sesenta y su descubrimiento por Hayflick y Moorhead, senescencia sigue siendo una curiosidad celular ^1. Las células humanas no proliferan indefinidamente y, por senescencia, Hayflick y Moorhead acuñaron el proceso celular de envejecimiento. La senescencia es una detención del ciclo celular estable en el que las células permanecen metabólicamente activa en oposición a la muerte celular. Hasta la fecha, cuatro mecanismos celulares se han mostrado para inducir la senescencia: acortamiento de los telómeros, daño en el ADN, perturbación de la cromatina, y la expresión anormal de oncogenes mitógenos ^2. Esto indica que no s....

Protocolo

1. Preparación de C12FDG, bafilomicina A1, y cultivo celular

1. Disolver el polvo de C ₁₂ FDG en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración final de 20 mM. Alícuota y almacenar a -20 ° C. DMSO se debe utilizar con las condiciones de seguridad adecuadas.
2. Disolver el polvo de bafilomicina A1 en DMSO a una concentración final de 0,1 mM. Alícuota y almacenar a - 20 ° C. Bafilomicina se debe utilizar con las condiciones de seguridad adecuadas.
3. Cultivar línea de medio RPMI 8226 celular, u otras líneas celulares adherentes o no, en medios que contienen 10% de suero fetal bovino y 1% de antibióticos, a 37 ° C, 5% de CO _2.

Resultados

Mieloma múltiple, un tumor maligno hematológico, se utilizó para evaluar la senescencia inducida por un procedimiento quimioterapéutico. Para ello una línea de células MM disponible en el mercado (RPMI 8226) fue tratado durante 2 días con doxorrubicina, un medicamento quimioterapéutico. Las células se sometieron luego a tratamiento bafilomicina A1 y ​​se incubaron adicionalmente con C ₁₂ FDG. Las células se analizaron por citometría de flujo. Figura 1 ilustra los diferentes pasos y muestra qu.......

Discusión

Presentamos aquí un método basado en citometría de flujo para cuantificar la senescencia celular en las células cancerosas vivas. Este método se basa en el uso del compuesto permeable a la membrana, el C ₁₂ FDG, y por lo tanto se puede utilizar en cualquier tipo de células y después de varios tratamientos, siempre y cuando el compuesto es absorbido por las células. Tras la captación celular, el C ₁₂ FDG es hidrolizado por la β-galactosidasa, enriquecido en los lisosomas de las células senescentes. .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-dodecanoilaminofluoresceína di-β-D-galactopiranósido	Invitrogen	D-2893
Dimetilsulfóxido Sigma		D2650
Bafilomicicina A1	Sigma	B1793
Doxorrubicina	Sandoz
Azul de tripán	Sigma	T8154
RPMI 1640 medio de cultivo celular	Lonza	BE12-702
Suero fetal de ternera PAA	Laboratories GmBH	A15 101
Antibióticos	Gibco	5290-018
Citómetro de flujo Gallios	Beckman Coulter	A94291