Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

Resumen

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con ³² P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.

Resumen

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs que comparten un dominio organización similar, incluyendo un dominio quinasa serina-treonina, un dominio de Ras proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio de la República de China (COR), y rica en leucina y repite-anquirina como en el extremo N-terminal. Las funciones celulares precisas de LRRK1 y LRRK2 aún no se han dilucidado, sin embargo LRRK1 ha sido implicado en la señalización del receptor de tirosina quinasa de ^1,2, mientras que LRRK2 está implicada en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson ^3,4. En este informe, se presenta un protocolo para etiquetar las proteínas LRRK1 y LRRK2 en células con ^{32P-ortofosfato,} proporcionando así un medio para medir los niveles generales de fosforilación de estas 2 proteínas en las células. En breve, la afinidad de las proteínas etiquetadas con LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene ³² P-ortofosfato. El ^{P-32-ortofosfato} es asimilado por las células después de sólo unos pocoshoras de incubación y todas las moléculas en la celda que contiene fosfatos de ese modo se marcaron radiactivamente. A través de la etiqueta de afinidad (3xFLAG) las proteínas LRRK están aislados de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía ⁽³² señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas. El protocolo puede ser fácilmente adaptado para controlar la fosforilación de cualquier otra proteína que se puede expresar en las células y se aisló por inmunoprecipitación.

Introducción

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs multidominio que comparten un dominio organización similar. Ambas proteínas codifican una secuencia de GTPasa similar a la familia Ras de GTPasas (RAS de Proteínas del Complejo, o ROC), así como un C-terminal de dominio ROC (CDR), la clasificación de manera efectiva ambas proteínas a la familia de proteínas ROCO ^5,6. N-terminal del dominio tándem ROC-COR, ambas proteínas codifican un dominio de repetición rica en leucina, así como un dominio de ankyrin como, mientras que sólo el LRRK2 codifica un armadillo adicional domein ^6-8. C-terminal de la República de China-COR, ambas pr....

Protocolo

El presente protocolo utiliza radiactivo ³² ortofosfato P-etiquetados para seguir fosforilación celular de LRRK2. Es importante tener en cuenta que todas las operaciones con reactivos radiactivos se deben realizar a través de medidas de protección adecuadas para reducir al mínimo la exposición de la radiación radiactiva para el operador y el medio ambiente. Los compuestos que contienen los isótopos que emiten radiación ionizante puede ser perjudicial para la salud humana y estricto proceso de autorización y reglamentos en un control de nivel institucional y nacional de su uso. Los experimentos en este protocolo se llevaron a cabo después del entrenamiento ....

Resultados

Con el fin de comparar los niveles generales de fosforilación de LRRK1 y LRRK2 en las células, 3xFLAG etiquetada LRRK1 y LRRK2 se expresaron en células HEK293T ^15. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos y se marcaron con ^32P y se analizaron como se ha descrito anteriormente en el texto del protocolo. Figura 1 muestra los resultados representativos para el etiquetado metabólico de LRRK1 y LRRK2 en células HEK293T. Incorporación de fosfato radiactivo se observa tanto.......

Discusión

Este documento proporciona un protocolo básico para el ensayo de nivel de fosforilación general de LRRK1 y LRRK2 en líneas celulares mediante marcaje metabólico con ^{32P-ortofosfato.} La estrategia general es sencillo. Etiquetados por afinidad proteínas LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene ³² P-ortofosfato. El ^{P-32-ortofosfato} es asimilado por las células después de sólo unas pocas horas de incubación y todas las moléculas en la célula que contienen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Radionúclido de fósforo-32, 1 mCi, tampón fosfato disódico en 1 ml de agua	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’ s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), líquido (alta glucosa)	Invitrogen	11971-025	Este medio no contiene fosfatos
Anti Flag M2 affiinty gel	Sigma	A2220	Para un producto equivalente con gel de color rojo (útil para visualizar más fácilmente las perlas), use cat. No. F2426.
Filtro secante extra grueso	Bio-Rad	1703965
Ponceau S solución	Sigma	P7170