Los métodos para realizar cruces en Setaria viridis, Un nuevo sistema de modelo para las gramíneas

Resumen

Hemos desarrollado una metodología para la realización de cruces en Setaria viridis (S. viridis). El método consiste en la poda de la panícula antes de un tratamiento de agua caliente para matar el polen viable. Cruces se realizan siguiendo un régimen de crecimiento bien controlada y típicamente dan lugar a la recuperación de 1 a 7 cruz de polinización semillas / s por panícula.

Resumen

Setaria viridis es un sistema modelo emergente para C ₄ pastos. Está estrechamente relacionado con la alimentación de la bioenergía de stock pasto varilla y la cola de zorra mijo la cosecha de grano. Recientemente, el genoma de 510 Mb de mijo de cola de zorra, S. italica, ha sido secuenciado ^1,2 y una secuencia del genoma 25x cobertura de la maleza relativa S. viridis está en curso. S. viridis tiene una serie de características que lo convierten en un sistema genético modelo potencialmente excelentes incluyendo un tiempo de generación rápida, baja estatura, las necesidades de crecimiento simples, la producción de semilla prolífica ³ y sistemas desarrollados para ambos transitoria y estable de transformación ^4. Sin embargo, la genética de S. viridis es en gran parte sin explorar, en parte, debido a la falta de métodos detallados para la realización de cruces. Hasta la fecha, no existe un protocolo estándar ha sido adoptado, que permita una rápida producción de semillas a partir de cruzamientos controlados.

La presión de protocoloented aquí está optimizada para realizar cruces genéticos en S. viridis, A10.1 adhesión. Hemos empleado un simple tratamiento térmico con agua caliente para la castración después de la poda de la panoja para retener 20-30 floretes y etiquetado de las flores para eliminar las semillas resultantes de flores recién desarrolladas después de la castración. Después de probar una serie de tratamientos térmicos a temperaturas permisivas y variando la duración de la inmersión, hemos establecido una temperatura óptima y el rango de tiempo de 48 ° C durante 3-6 min. Al utilizar este método, un mínimo de 15 cruces puede ser realizada por un solo trabajador por día y un promedio de 3-5 progenie outcross por panícula se puede recuperar. Por lo tanto, un promedio de 45-75 progenie outcross puede ser producido por una persona en un solo día. La amplia aplicación de esta técnica facilitará el desarrollo de poblaciones de líneas endogámicas recombinantes de S. viridis X S. viridis o S. viridis X S. italica, la cartografía de las mutaciones a través de mayor síanálisis gregant y creando mayores mutantes de pedido para el análisis genético.

Introducción

S. viridis es una NADP-ME subtipo C ₄ hierba muy relacionado con la alimentación de la bioenergía de stock switchgrass (NAD-ME subtipo), la cola de zorra mijo la cosecha de grano, y la mala hierba pasto guinea agrícola ^5. El genoma de 510 Mb de forma cultivada de Setaria, S. italica, ha sido recientemente secuenciado ^1,2 y una secuencia del genoma 25x cobertura de la maleza emparentada, S. viridis, está en curso (no publicado). S. viridis tiene una serie de características que lo convierten en un sistema genético modelo potencialmente excelentes incluyendo un tiempo de generación rápida, baja estatura, las necesidades de crecimiento simples, y la producción de semilla prolífica ^3. Es importante destacar que, métodos recientemente se han desarrollado tanto para transformación transitoria y estable de S. viridis, que proporcionan la oportunidad para la creación de plantas transgénicas ^4. Sin embargo, un importante cuello de botella en el desarrollo de herramientas genéticas para S. viridis es su recálculoItrance de fecundación cruzada. Hasta la fecha, no existe un protocolo estándar se ha publicado que permita una rápida producción de semillas a partir de cruzamientos controlados.

Cruces genéticos en S. italica comúnmente se realizan por la castración mediante la eliminación de las anteras de las flores ^6,7,8 o mediante el tratamiento térmico de las flores de los progenitores femeninos ^9-11. Después de estos tratamientos, las anteras o panículas de flores no tratadas / progenitores masculinos están desgastados suavemente contra los estigmas que liberan polen. En la emasculación, anteras son removidos usando unas pinzas finas inmediatamente después de abrir el florete y la antera está empezando a exsert, pero aún no ha emitido polen ^6-8. Entre los retos de este último método es la dificultad en la realización de la castración en un intervalo de tiempo estrecho entre la apertura y la liberación del polen de la flor. La duración de la apertura y el cierre de una sola flor variará dependiendo de la adhesión y la condición del medio ambiente, y puede variar de 7 min ^{6-2,5 horas 12 en S. italica. Desde el desprendimiento de polen se produce como anteras exsert del florete, anteras necesitan ser removidos con cuidado y de forma rápida, y por lo tanto, es difícil evitar la contaminación debido a la auto-polinización. Además, como polinizaciones se realizan inmediatamente después de la castración, el número de cruces que se pueden realizar por persona / por día es limitado.}

Como un método alternativo, panículas maduras se pueden sumergir en agua caliente para calentar-matar el desarrollo de los granos de polen ^9,10,13,14 con la ventaja de la realización de cruces en un gran número de panículas. Sin embargo, la temperatura y la duración del tratamiento térmico varía ampliamente de diferentes experimentos (por ejemplo, 47 ° C durante 10 min ¹⁴ y 42 ° C durante 20 min ^10). Por otra parte, no hay análisis sistemáticos sobre la eficacia de emasculaciones mediada por calor se han publicado. Por lo tanto, un método simple y estándar para llevar a cabo cruces genéticos en S. viridis aceleraría enormemente el desarrollo de los recursos genéticos y el establecimiento de S. viridis como un sistema modelo en la comunidad investigadora.

Se presenta el desarrollo y optimización de un protocolo estándar para la realización de los cruces genéticos en S. viridis. Las plantas se cultivan en ambientes controlados para sincronizar desarrollo de la flor y aumentar la reproducibilidad del procedimiento. Cruces se realizan usando un S. transgénico línea viridis como el progenitor masculino que contiene el gen indicador GUS ⁴ para facilitar la identificación de cruces genéticos controlados exitosas. El transgén GUS está dirigida por un promotor de ubiquitina de arroz que permite el marcador de semillas F1 inmediatamente después de la cosecha y por lo tanto proporciona un ensayo cualitativo fácil para determinar la eficiencia de la emasculación y polinización. Hemos empleado un simple tratamiento térmico con agua caliente para la emasculación acompañado de etiquetado de las flores que han sido emasculated para eliminar las semillas resultantes de flores recién desarrolladas después de la castración. Después de probar una serie de tratamientos térmicos a temperaturas permisivas y variando la duración de la inmersión en agua caliente, hemos establecido un tiempo y temperatura óptimos duraciones de 48 ° C 3-6 min. Se encontró un tratamiento en frío antes del amanecer para promover la floración sincrónica de ambos padres con el fin de facilitar la polinización cruzada. También hemos hablado de los pasos clave en el protocolo y la futura aplicación de este método a otras adhesiones Setaria.

Protocolo

1. Crecimiento de S. viridis

1. Establecer las condiciones de cámara de crecimiento a 31 º C/22 º C (día / noche), 12 hr hr light/12 oscuro, humedad relativa del 50% con un tratamiento antes del amanecer de 15 ° C de 08:30 AM a 9:00 AM. (Figura 1). En estas condiciones, S. viridis A10.1 dura unos 21-22 días de siembra a floración.
2. Rellene pisos (4 x 9 celdas) con Metro Mix 360 y eliminar una celda para el riego.
3. Agua ligeramente niebla en la superficie del suelo.
4. Siembre las semillas en la superficie del suelo, una semilla por celda.
5. Cubra las semillas con una capa de suelo (aproximadamente 0,5 cm)
6. Niebla de la superficie de pisos de suelo y agua de la parte inferior. Mantenga el riego desde el fondo después de la siembra de la semilla.
7. Para cada cruz que se lleva a cabo por lo menos tres plantas será utilizado como progenitores femeninos y nueve plantas se utilizará como progenitores masculinos. Siembra de las semillas debe ser escalonada como todas las plantas no florecen en el mismo día. Sowi Seedng se recomienda cada día durante un periodo de tres días.
8. El agua de las plantas de 1-2 veces al día, que depende del tamaño de las plantas y la condición del suelo. El exceso de agua en el suelo no es favorable para el crecimiento óptimo de las plantas, y puede conducir a la formación de hongos en el suelo y el daño de tejido de la hoja.
9. Fertilizar las plantas dos veces por semana, con Jack de 15-16-17 a una concentración de 100 ppm.

2. Recorte y Etiquetado de la panícula Antes Emasculación - Día 1

1. Por la tarde o por la noche antes de la polinización, mover las plantas a partir de la cámara de crecimiento para el laboratorio (temperatura (T): 24.06 ° C ± 0,13 ° C, la humedad relativa (HR) 21.79% ± 1.15%).
2. Seleccione las panículas primarias con 1 flor a 1/3 de las flores en la panoja que ya han florecido.
3. En este estudio los cuatro dominios dentro de la panícula se definen de la siguiente manera (Figura 2A; punta, medio distal, media y proximal base).
4. Idealmente, choospanoja ea con 1-5 flores que han brotado, se cortó la punta de la panícula (extremo distal), y eliminar todas las flores en el centro y la base de las secciones proximales utilizando tijeras de primavera o unas pinzas finas.
5. Si una panícula tiene alrededor de 1/10 a 1/5 de las flores que han florecido, corte la punta y cortar las flores desde la base de la panícula, sólo mantener la sección inferior del medio distal y sección superior de media proximal para su posterior recorte.
6. Si una panícula tiene alrededor de 1/4 a 1/2 de flores que han florecido, cortar la sección media distal y sólo retener la sección media proximal para su posterior recorte.
7. Utilice tijeras quirúrgicas para recortar ligeramente las cerdas.
8. Eliminar todas las flores que han florecido y todas las flores inmaduras salen aproximadamente 20-30 flores / panoja que se distribuyen de manera uniforme en la región (Figura 3). Practicar el cuidado de mantener las cerdas en la región que va a ser polinizadas con el fin de proteger a los flósculos de posible daño por calor.Para cada espiguilla, retener el florete más maduro superior. Las mayoría de flósculo superior tendrá una probabilidad más alta de la antesis en el momento de la polinización (Figura 2B).
9. Marque uno de los lados de cada flor con un marcador permanente rojo y registrar el número de florecillas en la panoja (Figura 2B).
10. Bandera de la panícula con la siguiente información: la fecha de castración, la duración y la temperatura a la que la castración se realiza.
11. Una vez que la panoja se recorta, quite todas las sierpes de cada planta para garantizar la reasignación de más recursos para el desarrollo de la panoja principal.

3. Emasculación con agua caliente-sellado - Día 1

1. Ajuste el baño de agua a 48 ° C ± 0,1 ° C para el tratamiento térmico.
2. Doble suavemente las panículas recortadas y sumergirlos en agua caliente a 48 ° C durante 3-6 min. Tenga cuidado de no romper el tallo de la panoja.
3. Cerca de 3-4 panículas se pueden sumergir togeTher a la vez, mientras se mantiene el espacio suficiente entre las panículas para la distribución uniforme del calor. Es esencial para sumergir toda la panoja en agua tibia durante el tratamiento térmico. La hoja bandera (la hoja que subtiende la panícula que proporciona los nutrientes a la panoja) no debe entrar en contacto con agua tibia para evitar el daño por calor al tejido de la hoja.
4. Una vez que la castración se realiza para la duración deseada, retire panículas del baño de agua y agite suavemente el agua de la panoja.
5. Coloque una bolsa de pan micro-perforado personalizado para cubrir la totalidad de la panícula castrado y seguro que con un toque de gala. Bolsas de pan microperforado se pueden personalizar de acuerdo con el tamaño de la panoja (incluir en el vídeo).
6. Coloque las plantas de nuevo en la cámara de crecimiento hasta el día siguiente.

4. Crossing / polinización después Emasculación - Día 2 y Día 3

1. A las 9:00 de la mañana del día 2 y el día 3, mueva femenina (castrado) y male los padres de la cámara de crecimiento en el laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21.79% ± 1.15%) para realizar cruces.
2. Observar y añadir otro punto rojo a flores que han florecido o están en flor con un marcador permanente rojo. Anote el número total de flores florecían por panícula.
3. Anote la fecha de la polinización y el nombre del progenitor masculino en la etiqueta para no perder de vista lo que se realizan cruces.
4. Observar el tiempo de pico de antesis en los padres varones. Bajo nuestras condiciones de la cámara (Figura 1) flores en las panículas del progenitor masculino comienzan apertura sincrónica alrededor de 10:10 AM. Desde el momento de la apertura de las flores, el exerción completa de anteras y liberación de polen se producirá después de 20 min.
5. El escenario ideal para la polinización es la etapa en la que se libera el polen del progenitor masculino. Las flores se cerrarán después de 20 min de la liberación del polen. Por lo tanto, la duración de la antesis es de aproximadamente 40 minutos desde el momento de la apertura de flujoers. El color de los cambios de polen de color blanco amarillento a marrón durante un período de aproximadamente 30 minutos después de la flor se cierra.
6. Inicie la polinización de inmediato una vez que las anteras de color blanco amarillento son visibles en las flores del progenitor masculino. Polinizaciones se realizan en el día 2 y el día 3 mediante el uso de una de las tres técnicas:
   1. -Panícula a panícula polinización: el uso de una panícula individual como el macho, frote suavemente la panícula junto con la panoja castrado para facilitar la polinización y desechar la panícula masculina para evitar la contaminación. Repita el proceso de polinización hasta que cada panoja castrado ha sido polinizada por 2-3 panículas.
   2. Antera al estigma-polinización: el uso de fórceps recoger una flor que está floreciendo con anteras de color blanco amarillento o elige anteras y físicamente tocan el estigma de la flor en el progenitor femenino. Utilice una flor del progenitor masculino para polinizar una flor en la panícula castrado. Repetir la polinización proceso hasta que cada estigma en la panoja castrado ha sido polinizada por unos pocos (cerca de 2-3) flores / anteras. El uso de un visor de aumento representará una mejor visibilidad para realizar la polinización.
   3. Entre las polinizaciones de diferentes progenitores masculinos, sumerja las pinzas en etanol al 95%, seguido de limpieza con Kimwipes para evitar la contaminación por arrastre de polen entre los diferentes cruces.
   4. Vinculante Panícula: Después de la emasculación, seleccione 3-4 panículas en el progenitor masculino que florecerán al día siguiente. Unirlas con la panícula castrado del progenitor femenino usando fijada por presión. Coloque la panícula castrado ligeramente por debajo de la panícula del progenitor masculino. Coloque una bolsa de papel cristal sobre las panículas y asegurar la bolsa en la base con un clip de papel. Esto puede ser completado en el día 2 una vez que las panículas del progenitor masculino comienzan antesis.
   5. Durante el tiempo que florece en la mañana del día 2 y el día 3, desplácese o agitar la bolsa de papel cristal para facilitar la polinización. Continuar a flick o sacuda panículas cada 15 minutos a lo largo de toda la duración de la floración de la mañana (entre las 9:00 AM-11: 00 AM). Retire panículas del progenitor masculino después de la polinización y la etiqueta de la parte opuesta de las flores florecían en la panoja castrado. Anote el número de flores florecían en la panoja de cada progenitor femenino.
7. Una vez que la polinización se ha realizado, coloque una bolsa de pan micro-perforado personalizado para cubrir la panoja del progenitor femenino y seguro en la base utilizando fijada por presión después de la polinización hasta la recolección de semillas.

5. La recolección de semillas

1. Semillas de la cosecha después de 2 semanas (14-16 días) a partir del día de la polinización. Coloque la etiqueta en la misma bolsa de las semillas. Las semillas que tienen marcas rojas en ambos lados representan las semillas resultantes de la cruza genética controlada. Estos se espera que sean progenie polinización cruzada.
2. Deseche cualquier semilla sin marcas rojas, ya que representanlas semillas que resultan de flores recién desarrollados después de la emasculación. Semillas con marcas rojas en un solo lado es probable que representan las semillas resultantes de la auto-polinización, ya que no estaban floreciendo en el momento en que se realizaron los cruzamientos controlados.
3. Las semillas secas a 30 ° C durante 2 días en un secador de semillas. Tienda de secado de semillas en el laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21.79% ± 1.15%) o en una cámara de semillas (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, humedad relativa: 20% ± 1%).

Resultados

En este estudio, hemos utilizado la S. secuenciado viridis A10.1 adhesión como progenitor femenino, y una S. transgénico line viridis (también A10.1) que contiene el gen reportero GUS ⁴ como el progenitor masculino para todas las polinizaciones. Un régimen de crecimiento optimizado se utiliza para sincronizar la floración, como se muestra en la Figura 1. Hemos probado varias combinaciones de temperatura y tiempo de tratamiento térmico para la emasculación y observó que alrededor del 40-80% de las flores que se mantengan a la panícula castrado floreció en el ^{segundo día} 2, mientras que el resto floreció en el ^3er día (Figura 2). Sin embargo, si el tratamiento térmico era demasiado grave, por ejemplo, 49 ° C durante 4 min, muy pocas o ninguna flor floreció en el ^{segundo día} 2. La polinización cruzada se realizó en el 2 ^º o 3 ^º día después de la castración, que dependía de la hora pico de la floración de progenitores masculinos.

Fue Observed que las flores jóvenes continuaron desarrollándose después de la castración, maduraron y auto-polinizadas polinizaciones 3-6 días después de controladas. Después de 7-10 días después de la polinización, las flores que son de color blanco son visibles en la panícula. Estas flores blancas son sin fertilizar ya sea debido a daños por el calor o la mala polinización. Al mismo tiempo, las flores que han sido polinizadas con éxito comienzan a producir semillas oscuras y empezar rompiendo después de 14 días. Las semillas negras con marcas rojas cosechadas a los ¹⁴ días después de la polinización se distinguían claramente de las semillas sin marcas rojas que aún estaban verdes y no se rompen. Si la cosecha se retrasa, el antecio de las semillas con y sin marcas rojas tanto un color oscuro, lo que hace que sea difícil distinguir rápidamente las semillas con marcas rojas en piscinas cosechados.

Para optimizar el protocolo se realizaron varios experimentos de cruce de tratamiento térmico como se resume en la Tabla 1. Un promedio de0-10 semillas / panoja fueron recuperados de los diversos experimentos de tratamiento térmico. Después de la cosecha, las semillas se secaron a 30 ° C durante 2 días en un secador de semillas seguido por la eliminación de la antecio utilizando un removedor de antecio. Después se retiró el antecio, semillas F1 putativos se tiñeron con solución de tinción GUS, y la progenie outcross tiñen de color azul en 1-2 hr (Figura 2F). Con base en estos resultados, se recomienda un tratamiento térmico de 48 ° C durante 3-6 min. Por otra parte, se recomienda que las cruces se realizarán tanto en el día 2 y el día 3 después de la castración.

Examinar la efectividad de esta técnica en la realización de cruces con otras accesiones o especies Setaria, cruces entre S. viridis A10.1 y ocho diversa S. adhesiones viridis y una S. Se realizaron pumila adhesión. Aunque días a floración varió entre las accesiones, se encontró que las flores de los ocho S. adhesiones viridis y una S.pumila adhesión comienzan abertura entre 10:00-11 a.m. con un tiempo de apertura máximo a 10:20-11 a.m. después del tratamiento en frío antes del amanecer. Esto indica que el tratamiento en frío antes del amanecer se puede aplicar a diversas adhesiones Setaria. Se utilizó un tratamiento térmico de 48 ° C durante 5-6 min para castrar S. viridis A10.1 que fue utilizado como progenitor femenino de todos los cruces realizados. Hemos recuperado de uno a 12 semillas de cruces entre A10.1 y tres de la diversa S. adhesiones viridis y seis semillas de un solo cruce entre S. viridis A10.1 y una sola S. adhesión pumila. Sin embargo, en este momento no hemos determinado si estas semillas fue resultado de un cruce de prueba con éxito o fueron el resultado de la auto-contaminación. Independientemente, estos resultados preliminares sugieren que las condiciones de crecimiento utilizadas para S. viridis A10.1 se puede utilizar para generar cruces con diversa S. adhesiones viridis y posiblemente otras especies de Setaria.

Temperatura de tratamiento térmico (° C)	Tiempo de tratamiento térmico (min)	# cruces	Promedio. # De flores después de ajuste	Día de la polinización (días después emasc)	Promedio. Semillas (rojo) / panoja (media)	Promedio. % Gus (+) / semillas (rojo)	Promedio. Semillas # hyb (Gus +)	Min # hyb semillas	Semillas hyb Max #
47	10	2	27	Segundo día	0	0	0	0	0
48	3	3	36	Segundo día	5	60	3	1	5
	4	3	25	3er día	10	50	5	3	7
	5	8	25	Segundo día	5	60	3	1	6
	6	3	25	Segundo día	4	75	3	0	4
	7	4	24	Segundo día	3	33	1	0	4
	7	1	25	3er día	4	75	3	N / A	N /La
49	1	3	23	Segundo día	5	25	1	0	2
	2	7	26	Segundo día	8	25	2	0	4
	3	5	22	Segundo día	0	0	0	0	1
	4	4	25	Segundo día	0	0	0	0	0

Tabla 1. Optimización del tratamiento de calor para la emasculación. Resultados de la alteración de la temperatura y tiempo de tratamiento térmico. Polinizaciones se realizaron uno (2 ^º día) o dos días (3 días ^rd) después de emasculación y cruzamientos exitosos scon alma de tinción GUS

Figura 1. Se muestran las condiciones de cámara de crecimiento optimizados con un pre-tratamiento de frío del amanecer. Temperatura y períodos de tiempo para un óptimo crecimiento y la sincronía de la producción de flores. Las flechas verdes y rojas muestran la ventana óptima para la realización de cruces y la emasculación, respectivamente.

Figura 2. Preparación para el cruce de la panícula y la tinción GUS de progenie outcross. (A) Una panícula de Setaria viridis A10.1 antes de recortar, mostrando aproximadamente 1/10 de las flores abiertas. Las cuatro secciones y direccionalidad en la progresión de la antesis lo largo de la panícula se muestra. (C) Una panícula castrado después de la eliminación de las cerdas. (D) Una panícula castrado el día 2 después de la castración, que muestra las flores que florecen (foto tomada a las 10:30 (A la panoja del progenitor masculino (Setaria viridis línea transgénica A10.1 llevando una β-glucuronidasa (GUS E)) gen informador) que está floreciendo después del tratamiento antes del amanecer (imagen tomada a las 10:30 AM). AM). A a través de E, barras de escala = 1 mm. (F) Putativo progenie outcross después de la tinción de GUS durante 2 horas seguido por distaining en 70% (v / v) de etanol. Los dos semillas de la derecha son controles negativos y positivos, respectivamente.

Figura 3. Diagrama de flujo del protocolo de una representación esquemática de la mpasos RINCIPALES involucrados en la ejecución de S. viridis cruza.

Discusión

Importancia del tratamiento antes del amanecer

Para obtener una alta frecuencia de progenie outcross que es fundamental contar con la antesis alta sincronía de progenitores masculinos y femeninos. Inicialmente, nos paseamos regímenes de temperatura y luz (31 ° C/22 ° C, día / noche) y utilizamos el S. viridis A10.1 la adhesión de todos los polinizaciones. En estas condiciones, la mayoría de las flores se abren temprano en la mañana, antes de que la temperatura se eleva a 31 ° C, aunque algunas flores abiertas al azar entre las 8:00 am-8: 00 AM. Estudios previos en S. italica indican que la hora del día, la ubicación y la temporada contribuyen a la variación en la antesis ^7,15,16. Siles et al. ⁶ señaló que la floración se asoció a cambios súbitos de temperatura y humedad, pero no con la baja temperatura y alta humedad, per se, como se ha concluido en estudios previos ^7,15. Por lo tanto, hemos empleado una de la madrugada el tratamiento en frío de 15 ° C durante 30 minutos (de 8:30 AM-9: 00 AM) para imitarla condición previa al amanecer natural. Este tratamiento en frío antes del amanecer ayudó en la sincronización de la floración en los padres. Hemos observado que a pesar de la configuración de la cámara para niveles de humedad relativa de 50%, la humedad relativa dentro de la cámara aumentó a un nivel por encima de 70% cuando la temperatura se redujo de 22 ° C a 15 ° C y continuó a mantenerse por encima de 70% hasta que la temperatura subió gradualmente a 31 ° C después de las 9:30 AM. A las 9:00 de la mañana, castrado progenitores femeninos y plantas de progenitor masculino se llevaron al laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21.79% ± 1.15%). Flores de los progenitores masculinos comienzan a abrirse alrededor de 10:10 de la mañana, y la polinización se pueden realizar a las 10:30 AM-11: 00 PM. Una lista detallada de todos los reactivos y el equipo se proporciona en la Tabla 2.

Importancia de la preparación de la panícula de emasculación

Bajo las condiciones de la cámara en este estudio (Figura 1), la duración de la floración panícula primaria varió desde2-3 días. Típicamente, las flores se encuentran en el medio distal de la inflorescencia (Figura 2A) se abren primero y apertura precede proximal y distal. El número ideal de flores para ser retenidas en la panícula es 20-30. Se debe tener precaución durante la extracción de las flores inmaduras de manera que se conservan sólo las flores bien desarrolladas (la flor más alta o más grandes en la espiguilla ^17). Etiquetado con marcador rojo en ambos lados de las flores ayuda a distinguir de manera eficiente la progenie de cruce abierto putativo a partir de semillas de flores recién desarrollados después de la emasculación. Además, es importante dejar las cerdas sobre las panículas antes de la castración para proteger los flósculos de extensa daño por calor, sin embargo, como una opción, que se puede quitar después de la emasculación usando tijeras de primavera con el fin de facilitar la polinización, especialmente cuando la unión una panícula técnica se emplea (Figuras 2C y 2D).

Con la temperatura óptimala duración del tratamiento d para el tratamiento de agua tibia

La base para la emasculación a través de inmersión en agua caliente es que el polen es más sensible al calor que la superficie del estigma. Sin embargo, la duración y la temperatura de los tratamientos térmicos pueden variar entre especies y accesiones Setaria. En general, una temperatura más alta con un tiempo de tratamiento más corto o una temperatura más baja con un tiempo de tratamiento más largo tendrá el mismo efecto en la emasculación. Se ha informado de que un tratamiento térmico de 42 ° C durante 20 min ¹⁰ o 47 ° C durante 10 min ¹⁴ S. prestados italica polen no viable, pero la eficacia de estos tratamientos no se determinó. Hemos desarrollado nuestro protocolo siguiendo la hipótesis de que bajo la temperatura óptima y la duración del tratamiento, el polen de todas las flores retenido en el progenitor femenino será inviable mientras estigmas seguirán siendo receptivos. Sin embargo, después de comparar y analizar los efectos de diferentes temperaturas yperíodos de tratamiento (Tabla 1), se encontró que la sensibilidad al tratamiento térmico varía entre las flores retenidos en cada panícula, por lo que es difícil de eliminar por completo las semillas resultantes de la auto-polinización. Llegamos a la conclusión de que la eficiencia de la producción de progenie polinización cruzada es la mayor cuando los tratamientos se llevaron a cabo a 48 ° C durante 3-6 min en S. viridis A10.1 adhesión.

Tiempo de pico de la floración y la polinización cruzada

Cuando las flores llegan a la madurez, y están a punto de abrir, las anteras son de color blanco amarillento y el polen se desprenden en cuanto anteras exsert de las flores ^8. Anteras convierten gradualmente marrón después de polen se desprende como las flores comienzan a cerrarse. Una vez liberado, la viabilidad del polen es desconocido. Por lo tanto, es muy importante utilizar el polen de apertura o flores recién abiertas en el progenitor masculino, tan pronto como sea posible. Bajo nuestras condiciones de la cámara (Figura 1), la mayoría de las flors de los progenitores masculinos empiezan a abrir a las 10:10 AM y las flores abiertas arrojan polen a las 10:30 AM. Así, la ventana conveniente para realizar la polinización es entre las 10:30 AM y las 11:00 AM. Los estigmas se mantienen fuera de las glumas después de flores cerca y pueden ser receptivos al polen. Esto se ha observado previamente y confirmado en S. italica que los estigmas son receptivos durante aproximadamente 48 horas después de la apertura de la flor por Siles et al. ^6, por lo que es importante para panículas bolsa tras el tratamiento térmico y después de la realización de cruzamientos controlados. Como se discutió anteriormente, se recomienda polinizaciones rendimiento tanto en el día 2 y el día 3 después de la castración.

Métodos para la polinización

Se comparó la eficacia de tres técnicas de polinización. Si no son limitantes flores floreciendo, la polinización-panoja a panícula es la técnica más eficiente y producirá un mayor número de progenie outcross. Si panículas florecen son limitantes, una mayor frecuencia de outcross progenie se produce cuando se utiliza el método de antera-al estigma. Hemos obtenido descendencia outcross de ambos métodos con éxito. El método "panículas de unión" se ha utilizado en el cruce S. italica ^6, pero nos pareció que este método es el método menos eficaz que la ventana de tiempo para el derramamiento de polen del progenitor masculino es corto. Por otra parte, hay menos control sobre la polinización y las cerdas sobre S. panículas viridis también pueden obstaculizar el movimiento del polen en la superficie del estigma.

Cosecha de semillas, secado y almacenamiento

Después de la cosecha, las semillas deben secarse a 30-33 ° C durante 2 días. Antecio deben ser eliminados para la tinción GUS, si es necesario. Las semillas deben ser almacenadas en un lugar fresco y seco (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21.79% ± 1.15%) para el almacenamiento a corto plazo (menos de dos años) o en una cámara de semillas (T: 4.0- 10 ° C ± 1,0 ° C, humedad relativa: 20% ± 1%) para el almacenamiento a largo plazo.Malas condiciones de almacenamiento pueden dar lugar a bajas tasas de viabilidad ^8. Hemos observado que la tasa de germinación de S. viridis A10.1 es de aproximadamente 5% cuando se siembra 4 días después de la cosecha, pero se puede aumentar a 90-96% después de almacenamiento en el laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) para 110 días posteriores a la cosecha seguida de una estratificación de tres días a -80 ° C para romper la latencia de las semillas. Para la estratificación a -80 ° C, semillas secas se pueden colocar en un recipiente hermético (por ejemplo, tubo de microcentrífuga o sobre moneda en una bolsa de plástico sellada) y se mantuvieron a -80 ° C durante 3 días antes de plantar. Después de 16 meses de almacenamiento en el laboratorio (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humedad relativa: 21,79% ± 1,15%), los porcentajes de germinación de 90-95% aún se puede obtener. Además, para romper la latencia, las semillas pueden ser secaron a 30-33 ° C durante 2 días después de la cosecha, y entonces se dan de tres días estratificación a -80 ° C, seguido de la eliminación de losantecio antes de plantar. Después de estos tratamientos, las tasas de germinación de semillas de hasta 33% se puede lograr.

Ventajas, limitaciones y posibles modificaciones

Aquí le ofrecemos el primer protocolo estándar para la realización de cruces en S. viridis A10.1 mediante el uso de un tratamiento de calor para la castración. A diferencia de la castración física, este protocolo es menos invasiva y relativamente fácil de establecer en un laboratorio. Por lo general toma alrededor de 15 minutos para recortar una panícula y unos 15 panículas se puede recortar y cruzó / persona / día. Asumiendo un promedio de 3-5 outcross progenie / panoja se puede recuperar en condiciones óptimas, con un total de 45-75 progenie outcross puede ser producido por una persona en un solo día. Además, esta técnica puede aplicarse a cruces en otras especies de Setaria, aunque optimizaciones adicionales serán probables. Si el espacio de cámara de crecimiento es limitado, las plantas pueden ser cultivadas en invernadero o cámara de crecimiento sin tratados antes del amanecertamento hasta la panícula emerge antes de que sean trasladados a las condiciones de la cámara optimizadas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tijeras, muelle	World Precision Instruments, Inc	14126
Pinzas, Dumostar Biology Polished	SPI Supplies	TD5BP-XD
	F.S.T (Fine Science Tools)	14005-12
Europack Bolsas de pan crujiente microperforadas de polipropileno transparente 6"x28"	http://www.pjpmarketplace.com	361001
Flats	T.O. Plastics	715401C
metropolitana 360	Hommert International	10-0356-1
Jack's 15-16-17	Hommert International	07-5925-1
Kimwipes	VWR International	34120
Sharpie Rotuladores Permanentes de Punta Ultra Fina,	Grapas	37002
Donegan DA-10 OptiVisor Lupa de diadema, aumento de 3,5x, distancia focal de 4"	Amazon	DA-10, B0015IP380
12"Embalaje 24/7 Sellador de impulso manual Máquina de sellado térmico Sellador de polietileno Empuñadura de elemento libre	Amazon	N/A
Baño de agua	Modelo científico de VWR	: 1166
BDW paseo en la cámara de crecimiento de plantas	Conviron	BDW 40