Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Resumen

Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca ^{2 +,} esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.

Resumen

Lesión de la membrana de plasma es un evento frecuente, y las heridas que ser reparado rápidamente para asegurar la supervivencia celular. La afluencia de Ca ^{2 +} es un evento de señalización clave que desencadena la reparación de heridas mecánicas en la membrana plasmática dentro de ~ 30 seg. Estudios recientes revelaron que las células de mamíferos también vuelven a sellar su membrana plasmática después de la permeabilización con formador de poros toxinas en un proceso de ^{2 +-dependiente} de Ca que implica la exocitosis de la esfingomielinasa ácida enzima lisosomal seguido por endocitosis de poro. Aquí se describe la metodología utilizada para demostrar que el resellado de las células permeabilizadas por la toxina estreptolisina O también es rápida y dependiente de Ca ^{2 +} afluencia. El diseño del ensayo permite la sincronización del evento lesión y una medición cinética precisa de la capacidad de las células para restaurar la integridad de la membrana de plasma mediante formación de imágenes y la cuantificación de la medida por la que el colorante liphophilic FM1-43 llega a las membranas intracelulares. Este vivo als ensayoO permite una evaluación sensible de la capacidad de exógenamente añadido factores solubles tales como la esfingomielinasa para inhibir FM1-43 afluencia, que refleja la capacidad de las células para reparar su membrana plasmática. Este ensayo nos permitió demostrar por primera vez que la esfingomielinasa actúa aguas abajo de Ca ^{2 +-dependiente} de la exocitosis, ya que la adición de la enzima extracelular promueve resellado de las células permeabilizadas en ausencia de Ca ^{2 +.}

Introducción

Se ha sabido durante varias décadas que reparación de la membrana de plasma después de la lesión mecánica es un ^1,2 Ca ^{2 +-dependiente} proceso. Estudios posteriores mostraron que el Ca ^{2 +} afluencia a través de la herida desencadena un proceso vigoroso de la exocitosis de las vesículas intracelulares en el sitio de la lesión, que se requiere para volver a sellar ^3,4. Se utilizó la tasa de pérdida de un colorante fluorescente cargado en el citoplasma de las células para evaluar la velocidad de la reparación, y llegó a la conclusión de que el resellado se completó dentro de <30 seg después de la lesión ^5. Dos model....

Protocolo

1. Transcripcional silenciamiento de la ASM

1. Semilla de 1,5 x 10 ⁵ células HeLa en 2 ml de medio de crecimiento DMEM (DMEM alto en glucosa con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) en platos inferior 35 mm de vidrio (MatTek) y incubar durante la noche a 37 ° C en el 5% de CO ₂ incubadora.
2. Al día siguiente, aspirado fuera de los medios de crecimiento y reemplazarlo con 2 ml de DMEM medio de suero reducido (DMEM con FBS al 4%), al menos 1 hora antes de añadir la mezcla de transfección de ARNsi.
3. Prepare 4 tubos para la mezcla de transfección siRNA oligo. En los tubos A y C, añadir 250 ....

Resultados

Las bajas concentraciones de reparación de la membrana plasmática esfingomielinasa (SM) de rescate de bacterias en las células agotadas en esfingomielinasa ácida lisosomal.

Usando el ensayo de formación de imágenes FM1-43, que anteriormente mostró que las células deficientes para el ASM enzima lisosomal y expuestos a SLO hiriendo en la presencia de Ca ^{2 +} tienen un defecto de membrana plasmática es rescatado por adición extracelular de la enzima humana recombinante ^19. Des.......

Discusión

Los primeros estudios sobre el daño y la membrana plasmática de reparación mecánica se basó en diversos mecanismos de las células hiriendo, que van desde dejar caer bolas de cristal, micropipeteo, esquila, rayaduras o arañazos. La lectura de todos estos ensayos fue de tipo cualitativo más que cuantitativo, y no dio información precisa sobre la cinética del mecanismo de reparación. La capacidad de las células para volver a sellar su membrana plasmática después de estas formas de lesión se midió por la presencia o ausenci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo
HeLa 229 línea celular	ATCC	CCL2-1
DMEM Alto Glucosa	Invitrogen	11965
DMEM Alta Glucosa No Calcio	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Suero Reducido	Invitrogen	31985
Lipofectamina RNAiMax	Invitrogen	13778
Medio de control Contenido de GC Oligo ARNi	Invitrogen 12935300
SMPD1 Oligo ARNi	Invitrogen	HSS143988
Suero bovino fetal Gemini-Bioproductos inactivados por calor		100-106
Esfingomielinasa de Bacillus cereus	Sigma	S7651
Platos con fondo de vidrio de 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Material
Microscopio invertido	Nikon	Eclipse Ti
Cámara	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Microscopio confocal de disco giratorio	PerkinElmer	UltraViewVoX
Análisis de software software	PerkinElmer	Volocity Suite
Cámara ambiental	Dispositivos de patología Cámara	sistema

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