Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Resumen

Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca ^{2 +,} esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.

Resumen

Lesión de la membrana de plasma es un evento frecuente, y las heridas que ser reparado rápidamente para asegurar la supervivencia celular. La afluencia de Ca ^{2 +} es un evento de señalización clave que desencadena la reparación de heridas mecánicas en la membrana plasmática dentro de ~ 30 seg. Estudios recientes revelaron que las células de mamíferos también vuelven a sellar su membrana plasmática después de la permeabilización con formador de poros toxinas en un proceso de ^{2 +-dependiente} de Ca que implica la exocitosis de la esfingomielinasa ácida enzima lisosomal seguido por endocitosis de poro. Aquí se describe la metodología utilizada para demostrar que el resellado de las células permeabilizadas por la toxina estreptolisina O también es rápida y dependiente de Ca ^{2 +} afluencia. El diseño del ensayo permite la sincronización del evento lesión y una medición cinética precisa de la capacidad de las células para restaurar la integridad de la membrana de plasma mediante formación de imágenes y la cuantificación de la medida por la que el colorante liphophilic FM1-43 llega a las membranas intracelulares. Este vivo als ensayoO permite una evaluación sensible de la capacidad de exógenamente añadido factores solubles tales como la esfingomielinasa para inhibir FM1-43 afluencia, que refleja la capacidad de las células para reparar su membrana plasmática. Este ensayo nos permitió demostrar por primera vez que la esfingomielinasa actúa aguas abajo de Ca ^{2 +-dependiente} de la exocitosis, ya que la adición de la enzima extracelular promueve resellado de las células permeabilizadas en ausencia de Ca ^{2 +.}

Introducción

Se ha sabido durante varias décadas que reparación de la membrana de plasma después de la lesión mecánica es un ^1,2 Ca ^{2 +-dependiente} proceso. Estudios posteriores mostraron que el Ca ^{2 +} afluencia a través de la herida desencadena un proceso vigoroso de la exocitosis de las vesículas intracelulares en el sitio de la lesión, que se requiere para volver a sellar ^3,4. Se utilizó la tasa de pérdida de un colorante fluorescente cargado en el citoplasma de las células para evaluar la velocidad de la reparación, y llegó a la conclusión de que el resellado se completó dentro de <30 seg después de la lesión ^5. Dos modelos fueron propuestos inicialmente para explicar la necesidad de la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática: 1) el modelo de "parche", lo que sugiere que el Ca ^{2 +} afluencia través de la lesión desencadena la fusión inicialmente homotípica de vesículas intracelulares, formando un "parche" de gran tamaño que haría a continuación, ser aplicada a la membrana plasmática para volver a sellar la herida ⁶ y 2) el modelo de reducción de la tensión, que propuso que la membrana Added por Ca ^{2 +-dependiente} de la exocitosis en las proximidades de la herida reduciría de plasma tensión de la membrana, facilitando de resellado de la bicapa de ^7. El papel de la Ca ^{2 +-desencadenó} la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática se ve reforzada por estudios que muestran que los lisosomas contienen una molécula de Ca ^{2 +} sensor, sinaptotagmina VII, lo que facilita su exocitosis y reparación de la membrana plasmática de las células lesionadas ^8,9,10,11 .

Sin embargo, la evidencia adicional ha indicado que la exocitosis por sí sola no era suficiente para promover la reparación de la membrana de plasma. Además de lágrimas mecánicas en la membrana plasmática, una forma frecuente de lesión de las células es la permeabilización por las toxinas formadoras de poros producidos por bacterias o células inmunes ^{12,13 14,15.} A diferencia de las lágrimas mecánicas, proteínas formadoras de poros se insertan en la membrana plasmática que forma un poro estable, proteína forrado de que no se puede volver a cerrarse simplemente mediante la aplicación de un "parche" de la membrana o por reduccióning tensión de la membrana. Curiosamente, los estudios revelaron que las células de mamífero tienen un mecanismo eficiente para reparar su membrana plasmática después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, y este proceso también requiere la presencia de ^{Ca2 +} extracelular ^12. Este hallazgo plantea la cuestión de si la supresión de poro transmembrana de la superficie celular era también un proceso rápido, como se observa con heridas mecánicas ^5. Sorprendentemente, nuestros estudios recientes revelaron que el resellado de las células permeabilizadas con toxinas formadoras de poros tiene propiedades muy similares a la reparación de heridas mecánicas: el proceso requiere extracelular de Ca ^{2 +,} y se completa dentro de ~ 30 seg. La investigación de este proceso con más detalle, recientemente hemos aprendido que, además de Ca ^{2 +-exocitosis} regulada de los lisosomas, reparación de la membrana plasmática implica una forma rápida de la endocitosis, que se activa por la liberación de la enzima lisosomal esfingomielinasa ácida (ASM) y es esencial no sólo para the eliminación de poros transmembrana, sino también para la reparación de heridas mecánicas ^16.

Para determinar la cinética de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, en nuestro laboratorio hemos adaptado una metodología de formación de imágenes en vivo que se había utilizado previamente para evaluar el resellado de las fibras musculares aisladas de láser-heridos ^17. Este ensayo se basa en las propiedades del colorante lipófilo FM1-43, que se intercala de manera estable en el prospecto exterior de las bicapas de lípidos que aumentan en intensidad de fluorescencia. Cuando la membrana bicapa de plasma se interrumpe ganancias de tinte extracelular acceso a membranas intracelulares, proporcionando un ensayo sensible para detectar lesión de la membrana plasmática y reparar ^18,16,19,20. Para adaptar este ensayo para la evaluación de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, que las células pre-incubaron a 4 ° C con la toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se une al colesterol de la membrana ^21. Celular síncronopermeabilización puede entonces lograrse fácilmente moviendo las células de hielo para calentar medio en una platina de microscopio calentado, que activa la oligomerización y cambio en la conformación que conduce a la formación de poros transmembrana. Una ventaja de este enfoque, en los ensayos previamente publicados utilizando heridas láser, es que un mayor número de células puede analizarse simultáneamente en un campo microscópico, proporcionando una mejor toma de muestras de la población celular. Dadas las similitudes mecánicas entre el proceso de resellado de células visto después de la lesión mecánica y la permeabilización con toxinas formadoras de poros, el ensayo como se describe aquí proporciona un método muy versátil y potente para factores implicados en el proceso fundamental de la reparación de la membrana de plasma de disección. Como un ejemplo, se muestra que es posible usar este ensayo para identificar los pasos de Ca ^{2 +} dependientes e independientes del proceso de reparación.

Protocolo

1. Transcripcional silenciamiento de la ASM

1. Semilla de 1,5 x 10 ⁵ células HeLa en 2 ml de medio de crecimiento DMEM (DMEM alto en glucosa con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) en platos inferior 35 mm de vidrio (MatTek) y incubar durante la noche a 37 ° C en el 5% de CO ₂ incubadora.
2. Al día siguiente, aspirado fuera de los medios de crecimiento y reemplazarlo con 2 ml de DMEM medio de suero reducido (DMEM con FBS al 4%), al menos 1 hora antes de añadir la mezcla de transfección de ARNsi.
3. Prepare 4 tubos para la mezcla de transfección siRNA oligo. En los tubos A y C, añadir 250 l de Optimem reducida suero y 4 l de Lipofectamine RNAiMax, por 35 mm de plato a ser transfectadas. En el tubo B, añadir 250 l de Optimem reducen el suero y 8 l (160 pmoles) de control de contenido GC medio oligo (Control siRNA), por placa de 35 mm a transfectar. En el tubo D, añadir 250 l de Optimem reducen el suero y 8 l (160 pmoles) de SMPD1 oligo (siasmo), por placa de 35 mm to ser transfectadas. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 5 min.
4. Combinar los tubos A y B para formar el complejo de transfección de ARNsi de control, y los tubos C y D para el ASM ARNsi. Se incuban las reacciones a temperatura ambiente durante 20 min.
5. Añadir las mezclas de reacción de transfección siRNA control y ASM siRNA lentamente, gota a gota, en los platos de fondo de 35 mm de vidrio respectivas y se incuba a 37 ° C / 5% CO _2. A las 24 h después de la transfección, aspirar suavemente de los medios de comunicación y reemplazar con medio de cultivo fresco DMEM. Para knockdown ASM eficiente, los platos deben ser incubadas a 37 ° C / 5% CO ₂ durante aproximadamente 31 horas (total 55 horas) antes de imágenes en directo.

2. Preparación de los reactivos para Live Microscopía

1. Preparar una solución de toxina de formación de poros recombinante estreptolisina O (SLO) a una concentración de 100 ng / l en frío 1x PBS sin ^{Ca2 +} y ^{Mg2 +.} La SLO utilizado en estos ensayos es un constitutively mutantes cisteína activa que no requiere agentes para reducir la actividad, proporcionado amablemente por Dr. Rod Tweten de la Universidad de Oklahoma. La toxina se expresó en E. coli BL21 DE3 y se purificó en condiciones nativas, como se ha descrito previamente ^16.
2. Preparar la solución de stock FM1-43: Resuspender FM1-43 polvo liofilizado en DMSO para crear una solución 25 mM.
3. Preparar Solución A: Se diluye la solución madre FM1-43 en DMEM frío con Ca ^{2 +} a una concentración final de 4 mM (se necesitan 1,5 ml por plato de MatTek) y almacenar en hielo hasta que se necesite.
4. Preparar la solución B: Diluir la solución madre FM1-43 en DMEM frío sin Ca mM de EGTA ^{2 +} y 10 (Ca ^{2 +-DMEM} libre) a una concentración final de 4 M (1,5 ml necesarios por plato MatTek) y almacenar en hielo hasta necesaria.
5. Pre-caliente (37 ° C) alícuotas de 1 ml de Solución A y Solución B en tubos Eppendorf.
6. Mantenga las soluciones de hielo de DMEM con Ca ^{2 +,} y Cun DMEM ^{2 +} libre.

3. Imágenes de células vivas de FM1-43 La afluencia en SLO células tratadas y no tratadas

1. Llenar un tamaño medio contenedor de metal poco profunda con hielo picado, invertir en un recipiente de vidrio grande con hielo, y añadir hielo adicional dejando sólo la superficie del fondo del recipiente metálico expuesto. Coloque una toalla de papel húmeda en la parte inferior de metal expuesto para permitir la transferencia térmica uniforme.
2. Tome un plato MatTek tratados con siRNA control (muestra 1) y colóquela sobre la toalla de papel húmeda y fría. Se aspira suavemente fuera todos los medios y lavar 3 veces con frío Ca ^{2 +} libre de DMEM. Después del último lavado, aspirado de todos los medios de comunicación en el plato.
3. Para la imagen asociada a la célula FM1-43 en las células no herida con SLO (Muestra 1) en la presencia de Ca ^{2 +,} añadir 180 l de solución fría B al cubreobjetos de vidrio centro de la placa inferior de 35 mm de vidrio y se incuba durante 5 min en hielo (Tabla 1).
4. Coloque el plato MatTek en el escenario de un microscopio confocal calentado a 37 ° C y equipado con una cámara ambiental (que mantiene la temperatura, humedad y niveles de CO _2). Encontrar el campo de las células que serán fotografiadas mirando a través de un 40X NA 1.3 objetiva (Nikon). Si está disponible, active PerfectFocus o un dispositivo similar para corregir la deriva térmica.
5. Añadir 1 ml de solución A precalentado suavemente a un lado de la placa de 35-mm y reemplace la tapa de la cámara ambiental (Tabla 1).
6. Adquirir imágenes de 4 min a 1 fotograma cada 3 s utilizando el software de imagen apropiada (Volocity en el sistema de hilatura de microscopía confocal de disco UltraView Vox Perkin Elmer). La excitación de FM1-43 se lleva a cabo con una línea de láser de 488 nm utilizando un filtro dicroico con un paso de banda de 488 nm, y la discriminación de emisiones se logra a través del uso de un filtro 527 (W55) de emisión. Niveles de potencia láser y sensibilidad de la cámara se ajustan para lograr la exposición de imagen de 100 ms.
7. Repita los pasos 3.2 a 3.6 para detectar FM1-43 en las células tratadas con siRNA control sin herir SLO (muestra 2) en ausencia de Ca ^{2 +,} excepto que en el paso 3.5 Solución B debe añadirse (Tabla 1).
8. Para medir FM1-43 afluencia en las células tratadas con ARNsi de control heridos con SLO ya sea en la presencia (muestra 3) o ausencia de Ca ^{2 +} (Muestra 4), ​​añadir 180 l de solución fría de SLO B que contiene al cubreobjetos de vidrio centro de la 35 mm de plato con fondo de cristal y se incuba durante 5 min en hielo como en el paso 3.3. Repetir los pasos 3.2 a 3.6; ajustar la adición de cualquiera de las soluciones A o la solución B en el paso 3.5 (Tabla 1).
9. Para determinar el papel de la ASM en reparación de la membrana de plasma, repita los pasos 3.2 a 3.6 usando células siRNA tratados con ASM para todas las condiciones (Muestras 5-8) (Tabla 1).
10. Para determinar el papel de la esfingomielinasa recombinante extracelular (SM) en lacinética de la reparación de la membrana plasmática (reflejados por la inhibición de FM1-43 afluencia) (muestras 9-10), se añade SM (0-50 mU) a cualquier solución A o la solución B en el paso 3.5 y luego añadieron a las células durante la células vivas formación de imágenes en un volumen total de 1 ml (Tabla 1).

4. Cuantificación de FM1-43 Afluencia en células

1. Después de las películas han sido adquiridos, medir la intensidad de la fluorescencia intracelular de FM1-43 utilizando el software de análisis de imágenes (Volocity Suite, PerkinElmer). Dibujar una región de interés en la región citosólica de cada celda en el campo y aplicar las herramientas de software para determinar la intensidad de fluorescencia FM1-43 media a lo largo de todos los fotogramas de vídeo.
2. Para ajustar las variaciones en el FM1-43 tinción inicial, los datos de cada vídeo se expresan como aumento veces en la intensidad de la fluorescencia con el tiempo, y se representaron gráficamente para cada condición diferente. El aumento de veces en la fluorescencia de cada punto de tiempo individual porde células se calcula como F _{V /} F _0, donde F _T es la fluorescencia media en el punto de tiempo específico, y F ₀ es la fluorescencia media en el momento t = 0 (figuras 1-2).

Resultados

Las bajas concentraciones de reparación de la membrana plasmática esfingomielinasa (SM) de rescate de bacterias en las células agotadas en esfingomielinasa ácida lisosomal.

Usando el ensayo de formación de imágenes FM1-43, que anteriormente mostró que las células deficientes para el ASM enzima lisosomal y expuestos a SLO hiriendo en la presencia de Ca ^{2 +} tienen un defecto de membrana plasmática es rescatado por adición extracelular de la enzima humana recombinante ^19. Des...

Discusión

Los primeros estudios sobre el daño y la membrana plasmática de reparación mecánica se basó en diversos mecanismos de las células hiriendo, que van desde dejar caer bolas de cristal, micropipeteo, esquila, rayaduras o arañazos. La lectura de todos estos ensayos fue de tipo cualitativo más que cuantitativo, y no dio información precisa sobre la cinética del mecanismo de reparación. La capacidad de las células para volver a sellar su membrana plasmática después de estas formas de lesión se midió por la presencia o ausenci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo
HeLa 229 línea celular	ATCC	CCL2-1
DMEM Alto Glucosa	Invitrogen	11965
DMEM Alta Glucosa No Calcio	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Suero Reducido	Invitrogen	31985
Lipofectamina RNAiMax	Invitrogen	13778
Medio de control Contenido de GC Oligo ARNi	Invitrogen 12935300
SMPD1 Oligo ARNi	Invitrogen	HSS143988
Suero bovino fetal Gemini-Bioproductos inactivados por calor		100-106
Esfingomielinasa de Bacillus cereus	Sigma	S7651
Platos con fondo de vidrio de 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Material
Microscopio invertido	Nikon	Eclipse Ti
Cámara	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Microscopio confocal de disco giratorio	PerkinElmer	UltraViewVoX
Análisis de software software	PerkinElmer	Volocity Suite
Cámara ambiental	Dispositivos de patología Cámara	sistema

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