Un Minuto, Sub-Uno-Watt fototérmica Ablación Usando Porphysomes, Intrinsic Multifuncional nanovesículas

Resumen

Desarrollamos nuevos nanovesículas multifuncionales intrínsecas llamados porphysomes, que tienen la estructura dependiente de fluorescencia propiedades fototérmicos únicas de auto-extinción y, por lo que funciona agentes de terapia fototérmica como potentes. Formulamos porphysomes por extrusión a alta presión y se investigó su eficacia de la terapia fototérmica en un modelo de tumor de xenotrasplante.

Resumen

Recientemente hemos desarrollado porphysomes como nanovesículas intrínsecamente multifuncionales. Un fotosensibilizador, pirofeoforbida α, se conjugó con un fosfolípido y luego auto-ensamblado de vesículas esféricas en liposomas similares. Debido a la altísima densidad de porfirina en la bicapa lipídica-porfirina, porphysomes generan grandes coeficientes de extinción, dependiente de la estructura de la fluorescencia de auto-extinción, y una excelente eficacia fototérmica. En nuestra formulación, porphysomes se sintetizaron usando extrusión de alta presión, y muestran un tamaño medio de partícula de alrededor de 120 nm. Inyección Veinticuatro horas después de la intravenosa de porphysomes, la temperatura local del tumor aumentó de 30 ° C a 62 ° C rápidamente tras la exposición durante un minuto de 750 mW (1,18 W / cm ^2), 671 nm irradiación con láser. Tras la ablación térmica completa del tumor, escaras formado y curado en 2 semanas, mientras que en los grupos de control de los tumores continuaron creciendo y todos llegaron a la linea definidapunto d dentro de 3 semanas. Estos datos muestran cómo porphysomes se pueden utilizar como terapia fototérmica potentes agentes (PTT).

Introducción

Porphysomes son novedosos nanovesículas multifuncionales que hemos desarrollado recientemente, que son capaces de imagen multimodal y la terapia ^1. Se forman a partir bicapas de porfirina auto-ensambladas y contienen una gran densidad de porfirina (más de 83, 000/porphysome de partículas), que genera gran coeficiente de extinción y los resultados en la fluorescencia única de auto-extinción dependiente de la estructura. Porphysomes tienen buenas in vivo farmacocinéticos y de biodistribución propiedades: que exhiben una vida media de 12 h de sangre después de la administración sistemática, y de forma pasiva se acumulan en los tumores de xenoinjertos con 7,5% ID / g a las 24 h después de la inyección ^2.

Su singular estructura y las propiedades físico-químicas hacen porphysome un buen candidato para la imagen multimodal y la terapia guiada por imágenes. En primer lugar, que contiene porfirina, porphysomes son intrínsecamente adecuados para imágenes de fluorescencia de los tumores de la acumulación del tumor ^1.Además, cada uno de porfirina tiene un sitio estable para radioisótopos quelantes, por lo tanto, porphysomes pueden ser fácilmente etiquetados con radioisótopos tales como 64Cu para formación de imágenes de PET ^3. Además, la energía de la luz absorbida se disipa térmicamente bajo exposición de irradiación láser cuando porphysome estructura está intacta, por lo porphysomes también exhiben formación de imagen fotoacústica único y capacidades de PTT. Se ha demostrado que 24 horas después de la inyección intravenosa de porphysomes, la irradiación con láser del tumor porphysome-acumulada indujo un aumento rápido de la temperatura y fuerte ablación del tumor fototérmica. Esto demostró que porphysomes son potenciadores fototérmicos eficientes, con un coeficiente de extinción tan alto como las nanopartículas de oro (AuNPs) ^1. Por otra parte, en comparación con otros agentes fototérmicos inorgánicos, incluyendo AuNPs, porphysomes muestran una ventaja excepcional en la bioseguridad debido a su naturaleza orgánica. Porphysomes son enzimáticamente biodegradable e inducen toxicit aguda mínimay en ratones con dosis intravenosas tan altas como 1000 mg / kg ^1. Además, de forma similar a los liposomas, la gran núcleo acuoso de porphysomes podría ser pasiva o activamente cargado con agentes terapéuticos o de formación de imágenes. Las propiedades ópticas y biocompatibilidad de porphysomes demuestran el potencial multimodal de nanopartículas orgánicas para imagen biofotónica y la terapia.

En este trabajo, presentamos el método de síntesis de los conjugados pirofeoforbida lípidos, la fabricación y el método de caracterización de porphysomes por extrusión a alta presión. In vivo PTT en ratones se lleva a cabo también para demostrar la eficiencia de porphysome habilitados PTT en el tumor tratamiento usando un modelo de tumor de xenoinjerto subcutáneo.

Protocolo

1. Síntesis de pirofeofórbido-lípido

1. Combinar 200 pirofeofórbido mmol (preparado a partir de Spirulina Pacifica algas como se describe anteriormente;... Zheng et al, Bioconj Chem., 2002, 13 -392) ^4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero -3-fosfocolina, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 mg de EDC, 48,7 mg de DMAP (4 - (dimetilamino) piridina) en 5 ml de cloroformo de amileno estabilizado para una proporción de 1:1:2:2 Pyro: Lípidos: EDC : DMPA.
2. Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente bajo argón durante 24 h. Evaporar el cloroformo bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio con calentamiento a 40 ° C. La mezcla de isómeros-piro piro lípidos (adjuntas en la posición sn-1 o sn-2) se produce.
3. Resuspender-piro lípidos mezcla de isómeros en 1 mM de _CaCl2, 50 mM Tris (pH 8), 0,5% de Triton X-100 y 10% de metanol a la concentración de 5 mg / ml. Añadir fosfolipasa A2 (PLA2) de miel veneno de abeja en el/ Ml de concentración 0,1 mg e incubar la solución a 37 ° C durante 24 horas para digerir sn-1 piro-lípido y para producir la posición sn-2-piro lípidos isómero puro.
4. Añadir 2 volúmenes adicionales de cloroformo y 1,25 volúmenes de metanol, extraer, y luego eliminar el disolvente mediante evaporación rotatoria a presión reducida a 40 º C. Resuspender el producto de escisión en 1% de MeOH en DCM y se purifica sobre una columna de sílice diol pequeño para el isoméricamente pura piro-lípido.

2. Preparación de Porphysomes

1. Disolver pirofeofórbido-lípido, diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-metoxi (polietilenglicol) (PEG-2000-PE) y colesterol en cloroformo separado, y registrar las concentraciones respectivamente.
2. Preparar porphysome película de lípido en un tubo de ensayo de borosilicato de 12x75 mm con un peso total de lípidos de 5 mg / tubo mediante la combinación de 65% molar de porfirina-lípido, 5% molar de PEG-2000-PE y 30% molar de colesterol.
3. Secar las películas lipídicas en una corriente de nitrogas generador y deje que se secan adicionalmente a vacío durante 1 hora. Almacenar las películas lipídicas a -20 ° C en atmósfera de argón hasta que la hidratación y extrusión futuro.
4. Añadir 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS, NaCl 150 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4) a cada tubo de película de lípidos. Congelar el tubo de ensayo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado, y luego descongelar el tubo de 65 ° C baño de agua hasta que la muestra se ha derretido. Vortex el tubo para un total de 30 seg (3x en 10 segundos cada uno, con 5 segundos de re-calentamiento en 65 ° C baño de agua entre cada agitación).
5. Repita la congelación-descongelación para 5 ciclos o más sobre sea necesario hasta que no hay grandes agregados pueden ser observados en la solución hidratada. Deje la suspensión porphysome en hielo cuando haya terminado.
6. Montar la extrusora de alta presión (10 ml) con dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm instalados pulg Conecte la extrusora thermobarrel a un circulador termostatizado para 65 ° C baño de agua circulante, y conecte el sistema extrusor a un tanque de nitrógeno de alta presiónAsegúrese de suministro.
7. Transferir la suspensión porphysome a la cámara de la extrusora con una pipeta de transferencia de vidrio de 9 pulgadas. Ajuste la presión girando el dial en el regulador del tanque de nitrógeno hasta que se observe una lectura de entre 200 y 300 psig como presión inicial de extrusión. Abrir la válvula del regulador de la presión gradualmente hasta que se alcanza la tasa de flujo suficiente porphysome o se alcanza un máximo de 800 psig (5440 kPa) de presión.
8. Después de la primera pasada de extrusión es completa, cerrar la válvula de control de presión y liberar la presión de la extrusora mediante la apertura de la válvula de alivio de presión en la parte superior del extrusor. Vuelva a llenar la extrusora con la solución porphysome recién extrusionados, y repetir la extrusión de al menos 10 veces para asegurar la solución extruido final es homogénea.
9. Determinar la concentración de la solución de porphysome final por la medición de la absorción de una muestra diluida en metanol por UV-Vis. Calcular la concentración usando la siguiente ecuación ingenioh el coeficiente de extinción de 97000 M ^-1 cm ^-1 a 410 nm para pirofeoforbida lípidos.

10. Medir la distribución de tamaño final de porphysomes utilizando un Malvern Zetasizer ZS90 por dispersión de luz dinámica. Diluir solución porphysome en PBS y se realizan tres mediciones con 15 carreras cada uno para los resultados promediados.
11. Determinar la extinción de la fluorescencia de porphysome mediante la comparación de la emisión de fluorescencia de porphysome se inactivó (1 mM en PBS) y porphysome insaciable (1 mM en 1% de Triton X-100) utilizando espectrofluorómetro. Tome los espectros antes y después de que el detergente (Tirton X-100) se añade, y normalizar la señal de lectura a la fluorescencia máxima. Establezca la excitación de ser 410 nm, y la emisión de longitudes de onda para ser 600-800 nm.
12. Mantenga solución porphysomes bajo argón a 4 ° C hasta su uso en el futuro, y protegerlo de la luz por el aluminio faceite.

3. Preparación de los animales modelo de xenoinjerto

1. Cultura de las células KB en RPMI-1640 (con 10% de SFB), y mantener las células en 5% de CO ₂ y la atmósfera humedecida a 37 ° C.
2. Células Harvest KB utilizando la técnica de cultivo celular estándar. Mantener la suspensión de células (20000 células / ml) en tampón fosfato salino (PBS) en hielo durante el almacenamiento a corto plazo hasta el momento de la inyección.
3. Preparar una KB xenoinjertos en ratones desnudos. Los ratones desnudos son adquiridos de Charles River Laboratories cuando son 20 g (Categoría # Crl: NU (NCR)-Foxn1 ^nu, de 6-7 semanas de edad), teniendo en cuenta la dieta estándar y ropa de cama (Harlan Laboratorios; Dieta: irradiado LM-485, # 7912; Ropa de cama: camas Mazorca de maíz, ¼ ", # 7097). Esterilizar todas las herramientas de manejo de animales (jeringas, pinzas, y la almohadilla animales) antes de los experimentos. Anestesie ratones con 2% de isoflurano v / v en el gas portador de oxígeno 100%. Todos los animales protocolos sean aprobados por la institución (Universidad Health Network en este caso) cuidado de los animales y el uso comité.
4. Inyectar las células tumorales suspendidas en PBS por vía subcutánea al flanco derecho de ratones. Los ratones son listo para ser utilizado después de 10 días cuando el tumor alcanza un diámetro de 4-5 mm y espesor de 2-3 mm.

4. In vivo la terapia fototérmica

1. Inyectar porphysomes (que contienen 750 nmol piro a 200 l de volumen) por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Llevar a cabo la irradiación láser de 24 horas después de la inyección de porphysomes.
2. En esta sección, llevar a cabo todos los procedimientos en una sala de seguridad del láser adjunto. Use gafas de seguridad láser durante la irradiación láser.
3. Configure el equipo de irradiación láser. Mantenga la fibra de láser y un difusor por una abrazadera en un soporte. Ajuste la potencia del láser a un nivel bajo y encienda el láser. Ajuste la altura de la fibra láser para lograr un área de irradiación de 9 mm de diámetro (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canadá), calibrar la potencia del láser a 750 mW (1,18 W / cm ²⁾ utilizando apower metros y luego se apaga el láser para preparar a los animales.
4. Se anestesia a los animales con isoflurano al 2% v / v en el gas portador de oxígeno 100% a través de cono de la nariz sin barrido evidente de isoflurano un peligro de riesgo para la salud humana). Confirme que el animal está anestesiado suficientemente profundo mediante la realización de una pizca dedo del pie con unas pinzas o los dedos a las patas traseras de los animales. Los animales están listos para la irradiación de láser cuando no responden a este procedimiento.
5. Controlar la temperatura del tumor mediante una cámara infrarroja térmica (Mikroshot, LumaSense Technologies). Coloque la cámara cerca del tumor, se centran bien y tomar una imagen pre PTT, así como una imagen de luz blanca regular antes de comenzar la irradiación de PTT.
6. Encienda el láser de nuevo, y aumentar la potencia de luz de 750 mW. Coloque el tumor en el centro del rayo láser para hacer el tumor totalmente cubierto, y empezar a cronometrar el irradiación. Tomar la imagen de la temperatura del tumor cada 5 s durante un tratamiento con láser un minuto. Apague el láser a 1 min. Stop el suministro de gas de 2% de isoflurano, espere hasta que se recupere de la anestesia de los animales y lo devolvió a la jaula.
7. Mantenga ratones a normotermia sala de animales bajo las 12:12 h oscuridad ciclo y la luz de acuerdo a los animales protocolos aprobados por la Universidad Health Network. Inyectar buprenorfina (0,05 mg / kg, por vía subcutánea dos veces al día durante una semana después de la irradiación con láser para reducir el dolor causado por la cicatriz. Cada dos días, mida el diámetro del tumor usando una pinza y tomar una foto. Calcular el volumen de los tumores utilizando la siguiente ecuación: V = π / 6 · a · b ^2, donde a es el diámetro de largo, y b es el corto.
8. Sacrificio de los animales poniéndolos en CO cámara ₂ cuando el diámetro largo del tumor llega a 10 mm, ya que es el punto final definido en nuestro laboratorio. Realice dislocación cervical después del tratamiento CO2. Trazar la curva de supervivencia.

Resultados

Pirofeofórbido se conjuga con el fosfolípido como un monómero de lípidos estable (Figura 1a) y el conjugados auto-ensamblan para formar porphysomes por el método de extrusión de la membrana usando una extrusora de alta presión. Por lo general es difícil de extruir suspensión porphysome lípidos en los 3 primeros ciclos de extrusión con una tasa de flujo relativamente lento. Como se repiten más extrusiones, la tasa de flujo de la solución extruido aumenta gradualmente, y la presión se puede disminuir lige...

Discusión

En el desarrollo de tecnologías de administración de fármacos, las nanopartículas multifuncionales son actualmente en amplias investigaciones para un seguimiento preciso del vehículo de suministro de fármaco mientras se mantiene una carga útil elevada de fármaco. Liposomas de porfirina-cargada se han desarrollado para mejorar las propiedades farmacocinéticas y la entrega más eficiente que la administración directa de porfirina, sino que existen obstáculos, incluyendo la cantidad de carga restringido de porfirina y rápid...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Evaporador rotativo	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236 Número de	modelo: G560
Extrusora de alta presión	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	Extrusora Thermobarrel de 10 ml
Circuladores de baño calentado (Circulador termostático)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Filtros de policarbonato	Avanti Polar Lipids	610005	Tamaño de poro 100 nm y diámetro de membrana 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
Espectrofotómetro UV/Visible	Varian Australia	Cary 50 Bio UV / Espectrofotómetro
Visible Espectrofluorómetro	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)	Hitachi	H-7000
incubadora de cultivos celulares	SANYO	MCO-18AIC
Medidor	de potencia Thorlabs	PM100D	con sensor S142C
671nm Láser	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Termómetro infrarrojo	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Gafas protectoras láser	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Densidad óptica: 1,5+ a 630-700 nm