Síntesis, Entrega y Celular En vivo Aplicación de sensores de pH basadas en dendrímeros

Resumen

Sensores de fluorescencia son herramientas poderosas en ciencias de la vida. Aquí se describe una metodología para sintetizar y utilizar sensores fluorescentes basadas en dendrímeros para medir el pH en las células vivas e in vivo. El andamio dendríticas mejora las propiedades de los tintes fluorescentes conjugados que conducen a propiedades mejoradas de detección.

Resumen

El desarrollo de indicadores fluorescentes representó una revolución para las ciencias de la vida. Genéticamente codificados y fluoróforos sintéticas con capacidades de detección permite la visualización de las especies de importancia biológica con alta resolución espacial y temporal. Los colorantes sintéticos son de particular interés, gracias a su elevada capacidad de ajuste y la amplia gama de analitos medibles. Sin embargo, estas moléculas sufren varias limitaciones relacionadas con la pequeña molécula de la conducta (mala solubilidad, las dificultades en la selección, a menudo no hay imagen radiométrica permitido). En este trabajo presentamos el desarrollo de sensores basadas en dendrímeros y presentamos un procedimiento para la medición de pH in vitro, en células vivas y en vivo. Elegimos dendrímeros como plataforma ideal para nuestros sensores por sus muchas propiedades deseables (monodispersidad, propiedades sintonizables, multivalencia) que los de un andamio ampliamente utilizado por varios dispositivos biomédicos hechos. La conjugación del pH fluorescenteindicadores al andamio dendrímero condujeron a una mejora de sus actuaciones de detección. En particular, los dendrímeros presentan reduce las fugas de células, mejorando la orientación intracelular y permitir mediciones radiométricas. Estos nuevos sensores se emplean con éxito para medir el pH en las células HeLa que viven e in vivo en cerebro de ratón.

Introducción

El uso de moléculas fluorescentes para etiquetar moléculas biológicamente relevantes específicos ha cambiado completamente la forma en que estudiamos sistemas biológicos. Widefield y microscopía confocal permitió un tiempo real de alta resolución de visualización de procesos biológicos y en la actualidad se encuentran entre las técnicas más populares para estudiar los eventos biológicos in vitro, en células e in vivo. ¹ Una mejora relevante estuvo representado por el desarrollo de indicadores de fluorescencia , es decir, colorantes cuya fluorescencia es dependiente de la concentración de una entidad molecular específica. indicado....

Protocolo

1. Síntesis de los Sensores

1. En la siguiente sección, se proporciona un procedimiento para la conjugación de indicadores de pH a dendrímeros PAMAM. El mismo protocolo se puede aplicar con modificaciones mínimas a dendrímeros de amina de soporte de alternativas. ^5,17,13,14 dendrímeros y colorantes comercialmente disponibles pueden ser utilizados sin más purificaciones.
2. Disolver el dendrímero en DMSO anhidro (concentración final 50 mM). Preparar soluciones madre 10 mM de fluoresceína-NHS y tetrametil-rodamina-NHS (TMR) en DMSO anhidro.
3. Añadir a la solución dendrímero la cantidad deseada de fluoresceína y TMR. La relación molar e....

Resultados

La figura 1 muestra una representación esquemática de la conjugación de detección de colorantes a diferentes andamios dendríticas. Los indicadores resultantes se pueden obtener en una etapa sintética fácil a partir de productos disponibles comercialmente. -Dendrímeros que llevan amina se hacen reaccionar con colorantes activada con NHS en DMSO y se purificaron por diálisis. Este procedimiento general ha sido ya utilizado con éxito para el etiquetado de varios dendrímeros: i) generación del dendrímero PA.......

Discusión

Los pasos críticos para formación de imágenes de pH éxito con sensores basados ​​en dendrímeros son: i) la selección del andamio dendríticas correcta y el número de indicadores conjugados a la misma y ii) la optimización de protocolo de entrega sensor en células o in vivo.

El procedimiento de síntesis es bastante fácil y se puede aplicar prácticamente a cada polímero hiperramificado amina-cojinete. Los sensores se pueden obtener de dendrímeros disponibles comercialmente y colorantes.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxifluoresceína NHS éster	Tecnologías de vida	C-1311
TMR NHS éster	Tecnologías de vida	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Bolsas de dialsis	Spectrum Labs	132117
Placas WillCo	Pozos WillCo	GWSt-3512
Uretano	Sigma-Aldrich	U2500