Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

Una de las cuestiones pendientes en la neurobiología del desarrollo se refiere al papel de los fenómenos de plasticidad sináptica durante la maduración sináptica. Nuestra investigación se centra en la comprensión de los mecanismos de plasticidad sináptica que subyacen en el desarrollo con un objetivo general de la comprensión del comportamiento de los animales en el contexto del desarrollo sináptico. Para ello, hemos desarrollado una preparación en gran parte intacto en un organismo (el pez cebra, Danio rerio), que ha alcanzado mucha tracción para estudios de desarrollo a finales de 1990.

El pez cebra ofrece varias ventajas para los estudios del desarrollo neurológico. Por ejemplo, su genoma es secuenciado y se puede llevar a cabo derribos morfolino y knockouts nucleasa dedo de zinc para silenciar la actividad de genes y expresión de proteínas. También se pueden realizar estudios de sobreexpresión y líneas transgénicas se pueden construir ^7-9. Los embriones son relativamente fácil y abundante para adquirir yla naturaleza transparente del embrión se presta bien a la formación de imágenes y estudios opto-genética. Además, el análisis del comportamiento puede llevar a cabo, y los experimentos electrofisiológicos se puede realizar en las fibras musculares, las neuronas de la médula espinal y las neuronas del cerebro posterior en los organismos en gran parte intactas, permitiendo uno para examinar la función celular in vivo. Es importante destacar que estamos en condiciones de examinar la actividad sináptica en no sólo el mismo tipo de célula, pero en el mismo par de neuronas, desde la preparación hasta la preparación. En otras palabras, esta es una de las preparaciones de vertebrados raros en los que se puede volver a la misma neurona, in situ, para estudiar su desarrollo.

A fin de mantener los circuitos neuronales tan viable como sea posible, hemos desarrollado una preparación en la que la parte posterior del cerebro y la médula espinal se dejaron intactos, mientras que el parche de sujeción de las células-M. En esta preparación, los ojos, la mandíbula y la piel que recubre la cerebro se eliminan con suavidad y la parte posterior del cerebro es peeled lejos de la notocorda, permitiendo el acceso a la superficie ventral del cerebro posterior. Las neuronas reticulospinal se encuentran unos pocos micrómetros de profundidad y son relativamente de fácil acceso. En 48 h después de la fecundación (HPF; algunas abreviaturas se listan en la Tabla 1) las células son eléctricamente compacto y una fidelidad puede registrar la actividad sináptica (tanto excitatorios e inhibitorios corrientes), las corrientes de voltaje y los potenciales de acción de los mismos.

Nuestros hallazgos sugieren que se producen muchos aspectos del desarrollo y la maduración sináptica en el 24 horas antes de la eclosión, y por lo tanto gran parte de nuestra atención se centra en los organismos de edades comprendidas entre 24 a 72 HPF HPF. Sin embargo, por 72 HPF, células M son menos compacto eléctricamente y son difíciles de abrazadera adecuadamente espacio. La técnica se puede utilizar para grabar no sólo de las células M, sino también de sus homólogos, MID2 cm y MiD3 cm. En teoría, también se puede realizar grabaciones dobles, de un spneurona espinal inal como una neurona motora primaria y de la de las células M, pero esto es difícil y se podría argumentar que los beneficios que se obtienen a partir de una técnica tan difícil puede no valer la pena el esfuerzo extraordinario que se requiere.

1. Preparación y disección

1. Preparar el plato forrado con disección Sylgard. Cámaras de grabación de WPI (Sarasota, Florida, EE.UU.; proveedores están listados en la Tabla 2) se utilizan como la disección de los platos (Figura 1). Las cámaras están diseñados para dar cabida a portaobjetos de vidrio y pequeñas arandelas de plástico se utilizan como moldes para la Sylgard. Las arandelas se fijan primero a la diapositiva con grasa y Sylgard líquido se añade al centro de la arandela. El Sylgard curará durante la noche y mientras lo hace, se forma una pequeña cama, circular en el portaobjetos de vidrio, que se convierte en la base del plato de disección. El portaobjetos se coloca en la cámara de registro y sirve como la base de la cámara a la que está fijada la preparación (Figura 1).
2. Preparar las soluciones que se indican en la Tabla 3. Soluciones extracelulares deben dejarse a temperatura ambiente mientras que las soluciones intracelulares deben mantenerse estériles. También se puede añadir Lucifer de color amarillo (0,1%) a la solución intracelular de manera que la visualización de la morfología de las células M puede ser realizado al final del experimento. Esto sirve para confirmar la identidad celular (Figura 2).
3. Levante salvajes embriones de pez cebra de tipo en el agua de huevo a 28,5 ° C, así como recopilar y etapas según Kimmel et al. ^10. Para las disecciones, transferir los embriones al plato de disección que también sirve como la cámara de grabación. Anestesie de 7-10 minutos en una solución anestesiar sal (0,02% tricaína; solución 1, Tabla 3) que se aproxima estrechamente solución salina fisiológica. Uno puede determinar si están adecuadamente anestesiados mediante el examen de la respuesta a una pizca de cola suave.
4. Pin de los embriones a través de la notocorda y sobre el plato Sylgard forradas con 0.001 "alambre de tungsteno (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, EE.UU.), utilizando magnificación 25X en un microscopio de disección (Figura 1). El alambre de tungsteno se corta fácilmente ena pequeños segmentos con tijeras de disección finas.
5. Ajuste el aumento en el microscopio de disección a 40-50X para llevar a cabo la disección. Una vez que el embrión se fija en el plato, la mandíbula, los ojos y el cerebro anterior se eliminan usando un buen par de pinzas (Dumont # 5).
6. El cerebro posterior se pela suavemente lejos de la notocorda subyacente al trabajar cuidadosamente las pinzas entre la notocorda y el cerebro. La parte posterior del cerebro es convertido suavemente de manera que la superficie ventral hacia arriba. Esta posición ofrece un buen acceso a las células M, que son por lo general dentro de 5 a 10 micras de la superficie ventral de embriones jóvenes y ~ 20-50 micras de larvas de mayor edad (Figura 2A).
7. Cuidadosamente mueva la preparación a la configuración de la grabación donde se puede realizar el experimento de patch clamp. Las células M se visualizan con Nomarski contraste de interferencia diferencial (DIC), aunque otros modos de formación de imágenes (es decir, de contraste de modulación de Hoffman o de contraste de imagen de Dodt GradienteLuigs y Neumann, Alemania) también se pueden utilizar.

2. Patch Clamp de grabación (modo de célula entera)

1. Todas las grabaciones se llevan a cabo en todo el modo de pinzamiento zonal de célula ^11. Cámaras de grabación se colocan sobre una platina de microscopio en una configuración de electrofisiología. Nuestros estadios son fijos y el microscopio de patch clamp en posición vertical se atornilla a una plataforma de microscopio móvil o un traductor de microscopio.
2. Pipetas de patch clamp se tiran en un extractor horizontal (P-97; Sutter Instruments Co.) de vidrio de paredes delgadas borosilicato obtenida de WPI. Diámetros de punta de pipeta son del orden de 0,2 a 0,4 micras después del pulido fuego a un borde liso, y la puesta a punto del vástago es de ~ 4 mm de longitud.
3. Coloque la pipeta para la etapa de la cabeza del amplificador en la configuración de la electrofisiología. Es importante mantener la etapa de la cabeza en más o menos 45 ° ángulo con el eje horizontal ya que esto asegura un ángulo de entrada de la pipeta que es adecuado para la formación de sello de alta resistencias sobre la célula de Mauthner.
4. Justo antes de entrar en la solución del baño, aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para reducir el riesgo de ensuciar la punta. Al grabar mEPSCs, soluciones de baño incluyen 1 M TTX para bloquear los potenciales de acción, 5 M estricnina para bloquear los receptores de glicina y 10 bicuculina M o 100 picrotoxina M para bloquear los receptores de GABA _A. Cuando se graba mIPSCs, soluciones de baño incluyen 1 TTX M, ácido quinurénico y, o bien bicuculina o estricnina dependiendo de la actividad del receptor de interés.
5. El enfoque de la célula-M con una pequeña cantidad de presión positiva en la pipeta. La presión positiva empuja suavemente la célula de lado a lado y cuando se coloca inmediatamente sobre la celda, forma un pequeño hoyuelo en la membrana celular. Agregar la pipeta en el lugar durante unos pocos segundos para limpiar suavemente la superficie de la célula de manera que se puede formar un sellado fuerte entre la pipeta y la membrana. Liberar la presión positiva en la pipetapermite que el sello para ser iniciado y una pequeña cantidad de presión negativa junto con los potenciales de pipeta negativos resulta en juntas que forman GigaΩ dentro de unos pocos segundos.
6. Cambie el potencial de explotación en el amplificador a -60 mV. Ruptura de la membrana celular con una serie de pulsos cortos de succión. Inmediatamente registrar los potenciales de membrana y minimizar los artefactos de capacitancia. Compensar capacitancia celular (C _m) y el acceso (serie) de la resistencia (R _a) por 70 a 85%. _Ra deben monitorizarse de forma rutinaria, cada 30 segundos a un minuto, y si hay un cambio de 20% o más, abortar el experimento.
7. Una vez que el experimento ha terminado y suficiente de datos se ha adquirido, la preparación se sacrificó mediante la eliminación de la parte posterior del cerebro con un par de pinzas. En este punto, el análisis de datos puede comenzar.

En este manuscrito se presenta un método para la grabación de patch-clamp en el modo de células enteras de neuronas reticulospinal en el pez cebra, centrándose especialmente en el de las células M. Por supuesto, también es posible grabar en otros modos de patch clamp de células tales como conectado, de dentro a fuera y fuera a cabo. El tipo de datos que se puede obtener no se limita a lo que hemos presentado aquí, pero tratamos de dar un ejemplo tanto de la actividad sináptica (excitatorios e inhibitorios) en el modo de fijación de voltaje, así como los potenciales de acción en la pinza de corriente. Como las edades del organismo y las células M desarrollan dendritas más extensos y elaborados, la capacidad de tensión adecuadamente la abrazadera y el espacio sujetar la célula se ve comprometida y el modo de abrazadera de corriente se convierte en la grabación de elección.

La Figura 3 muestra grabaciones representativas de las corrientes excitadoras de los receptores AMPA y NMDA obtenidos a partir de embriones de 48 hpf en presencia de TTX (1 M) y agentes farmacológicos abloquear los receptores de GABA y de glicina. Cuando las células M son tensión sujeta a -60 mV, las corrientes sinápticas son debido a la activación de los receptores de AMPA (Figura 3A). Adquisición y análisis de estos eventos permite grabar parámetros tales como tiempo de subida, tiempo de caída, la amplitud y la frecuencia. Eventos AMPA suelen tener un rápido tiempo de subida (20-80% tiempo de subida de ~ 0,1 ms) y el tiempo de caída (~ 0,5 ms), y presentan una amplitud promedio de aproximadamente 25 pA. Cuando las células M se sujetan a 40 mV, las corrientes hacia el exterior resultantes se deben a AMPA y NMDA actividad del receptor (Figuras 3C y 3D). Corrientes del receptor NMDA presentan cursos de tiempo más largos que los receptores de las corrientes AMPA, y necesitan ser registrados a potenciales positivos o en solución Mg libre para quitar el bloqueo de Mg del NMDA receptores 2,6. El mEPSC media se muestra en la figura 3D representa las corrientes AMPA y NMDA mixtos registrados a 40 mV.

Figura 4 muestra los resultados representativos al grabar mIPSCs a partir de células de Mauthner. Estos acontecimientos se produjeron en presencia de TTX (1 M) y ácido quinurénico (1 mM) para bloquear los receptores AMPA y NMDA. Estos eventos presentan aumento razonablemente rápida y cinética de descomposición por 48 HPF y son lo suficientemente frecuentes para adquirir muchas de ellas a través de una grabación 3 min 2-3. Figura 5 muestra los potenciales de acción registrados como resultado de la inyección de corriente de despolarización en la célula. Células M de 48 HPF embriones usualmente disparan un solo potencial de acción (figura 5B), aunque a veces disparan múltiples puntos de acceso cuando se inyecta con estímulos suprathreshold (Figura 5A).

Tabla 1.

Tabla 2.

Tabla 3. Todas las soluciones extracelulares se ajustan a 290 mOsm y pH 7,8. Todas las soluciones intracelulares se ajustan a 280 mOsm y pH 7,4.

Figura 1. La disección de plato y la preparación de cordón posterior del cerebro espinal intacta. (A) La disección y registrando plato obtenida de WPI. Una arandela delgada se sella con cuidado sobre Tque portaobjetos de vidrio en la parte inferior del plato y Sylgard se aplica al pozo. (B) 48 HPF rombencéfalo-médula espinal preparación. La superficie ventral del cerebro posterior quede hacia arriba y la de las células M se encuentra justo debajo de la superficie del tejido en el nivel de la punta de flecha.

Figura 2. (A) Imagen de contraste de interferencia diferencial de Nomarski de una célula M obtenido a partir de un embrión de 2 dpf poco después de la eclosión. La imagen fue tomada después de la grabación espontánea actividad sináptica excitatoria de la célula-M. (B) La célula se llenó con Lucifer amarillo durante el experimento. Adaptado de 12 con autorización.

Figura 3. (A) mEPSCs AMPA espontáneas registraron a partir de una célula M en una explotación potencial de -60 mV. (B) Promedio de mEPSCs obtenidos a partir de la grabación en (A). (C) espontánea AMPA y NMDA (puntas de flecha) mEPSCs registrada a partir de una de las células M a un potencial de mantenimiento de 40 mV. (D) Promedio de mEPSCs obtenidos a partir de la grabación en (C). MEPSCs de glutamato se registraron en presencia de TTX (1 M) para bloquear los potenciales de acción, estricnina (5 M) y picrotoxina (100 M) para bloquear las corrientes de glicina y GABA.

Figura 4. (A) mIPSCs espontáneas grabadas desde una célula M a un potencial de mantenimiento de -60 mV. (B) Promedio de mEPSCs obtenidos a partir de la grabación en (A). mIPSCs se registraron en presencia de TTX (1 M) para bloquear los potenciales de acción, ácido quinurénico (1 mM) para bloquear la actividad del receptor de glutamato y bicuculina (10 M) para bloquear las corrientes de GABA.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.