Se describe el uso de colorantes de estirilo FM a la imagen de reciclado de vesículas sinápticas en las terminales nerviosas funcionales. Este protocolo se puede aplicar no sólo a evocada, sino también espontánea y actividades sinápticas en miniatura. El protocolo se expande la variedad de eventos sinápticas que pueden ser evaluados de manera eficaz.
Artículo de método
El examen de la vesícula sináptica Reciclaje utilizando tintes FM Durante Evocados, espontánea, y actividades sinápticas miniatura
En este artículo
Resumen
Resumen
Las vesículas sinápticas en las terminaciones nerviosas funcionales sufren exocitosis y endocitosis. Este reciclaje de vesículas sinápticas puede ser analizada de manera efectiva el uso de tintes estirilo FM, que revelan el volumen de negocios de la membrana. Protocolos convencionales para el uso de colorantes FM fueron diseñados para el análisis de las neuronas siguiente estimulada (evocado) la actividad sináptica. Recientemente, los protocolos se han hecho disponibles para el análisis de las señales de FM que acompañan las actividades sinápticas más débiles, como los eventos sinápticas espontáneas o en miniatura. El análisis de estos pequeños cambios en las señales de FM requiere que el sistema de formación de imágenes es lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en la intensidad, sin embargo, que los cambios de artefactos de gran amplitud se suprimen. Aquí se describe un protocolo que se puede aplicar a evocado, espontánea, y actividades sinápticas en miniatura, y el uso de las neuronas del hipocampo en cultivo como un ejemplo. Este protocolo también incorpora un medio de evaluar la tasa de fotoblanqueo de tintes FM, ya que es un importantefuente de artefactos cuando se generan imágenes pequeños cambios en la intensidad.
Introducción
La funcionalidad de las vesículas sinápticas es un determinante importante de la transmisión sináptica. Estas vesículas liberan neurotransmisores cuando se fusionan con la membrana plasmática presináptica (exocitosis), y se convierten listo para otro ciclo de la liberación después de ser regenerado a partir de la membrana plasmática (endocitosis) y cargado nuevamente con neurotransmisores. La investigación sobre la dinámica de los mecanismos subyacentes y el reciclado de la vesícula sináptica se ha acelerado en gran medida por la introducción de colorantes estirilo FM 1. Estas moléculas anfipáticas, que se carga positiva grupos de cabeza hidrófilos y colas....
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Protocolo
1. Cultivo primario de neuronas de cerebro de los mamíferos
Todos los animales procedimientos realizados en este estudio han sido aprobados por el Comité de la Universidad de Iowa Institucional Cuidado de Animales y el uso.
- Preparar el cultivo de células disociadas de las regiones CA3-CA1 del hipocampo de ratones o ratas en los días postnatales 0-1 19,20. Placa de las células del hipocampo en cubreobjetos de 12 mm (espesor número 0) preconfiguradas con la capa alimentadora glial de rata, en placas de 24 pocillos, y a una densidad de 12000 células / pocillo.
- Cultura de las neuronas del hipocampo durante por ....
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Resultados
A modo de ejemplo, mostramos los resultados representativos de la evolución en el tiempo de decoloración de las vesículas sinápticas (Figura 4). Las neuronas del hipocampo cultivadas se tiñeron con FM4-64 utilizando la actividad sináptica espontánea (paso 2,3) y se lavaron con solución libre de colorante (solución de lavado 2). La imagen muestra el curso inicial de tiempo de decoloración utilizando la actividad espontánea (paso 5.3) (parte inicial de la línea continua de la Figura 4A). .......
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Discusión
Hemos descrito protocolos para la tinción y la decoloración se deben vesículas sinápticas en respuesta a evocado, la actividad sináptica espontánea y miniatura, y para formación de imágenes durante la fase de decoloración. Además de los protocolos existentes, se ha incluido un nuevo protocolo de observación de la decoloración FM basado en la actividad sináptica en miniatura. El uso de estos protocolos, hemos identificado previamente anormalidades en las neuronas cultivadas a partir de un modelo de ratón de la distonía t.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Harata útil para los debates a lo largo de la ejecución de este trabajo. Este trabajo fue financiado por becas de la Asociación Americana del Corazón, la Fundación Distonía Investigación Médica, el Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la Fundación Nacional de Ciencias y la Fundación Whitehall a NCH
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Generador de pulsos | AMPI | Master-8 | |
| Estimulador aislado |  Digitimer | DS3 | |
| Microscopio invertido | Nikon | Eclipse TS100 | Se utiliza para evaluar la morfología celular a baja magnificación. |
| Microscopio invertido | Nikon | Eclipse TiE | Se utiliza para imágenes de fluorescencia y de luz transmitida de alta resolución, con mínima deriva del enfoque. |
| Lente objetivo | Nikon | Se recomienda una lente de inmersión en agua. Una lente de inmersión en aceite puede utilizarse a menos que la estructura observada esté profunda respecto a la superficie del cubreobjetos (por ejemplo >10 μm). | |
| Cubo de filtros | Nikon | 77032509 | 490/20 nm ex, dclp de 510 nm, em de 520 nm LP para FM1-43 |
| Cubo de filtros | Nikon | 77032809 | 490/420 nm ex, dclp de 510 nm, em de 650 nm LP para FM4-64. |
| Cámara EMCCD | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | Esta cámara EMCCD se utiliza para la detección de fluorescencia de alta sensibilidad. |
| Enfriador con recirculación de líquido | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | Se utiliza para perfundir continuamente la cámara con agua fría para mantener una temperatura de -80°C y reducir así el ruido. |
| LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | Esta fuente de luz se utiliza para el control rápido de encendido/apagado de la excitación de fluorescencia. |
| Software de adquisición de imágenes | Andor Technology | Solis | |
| Cámara de imagen | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
| Sistema de perfusión rápida | Warner Instruments | SF-77B | |
| CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
| D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
| Tetrodotoxina | Tocris Bioscience | 1069 | Precaución: reactivo tóxico. Manejar con cuidado. |
| FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
| FM1-43 fijable con aldehído (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
| FM4-64 fijable con aldehído (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks’ | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| Medio Mínimo Esencial | Invitrogen | 51200-038 | Esta solución no contiene rojo de fenol, que podría interferir con la imagen de fluorescencia. |
| Paraformaldehído | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Precaución: reactivo tóxico. Manejar con cuidado. |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S7903 |
Referencias
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1
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