El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Resumen

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

Resumen

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento y la regeneración de las neuronas olfatorias primarias. De hecho, el sistema olfativo principal se caracteriza por su capacidad para dar lugar a nuevas neuronas, incluso en los animales adultos. Esta habilidad particular, se debe en parte a la presencia de la OECO que crean un microambiente favorable para la neurogénesis. Esta propiedad de OECs se ha utilizado para el trasplante celular, tales como en modelos de lesión de la médula espinal. Aunque el sistema nervioso periférico tiene una mayor capacidad de regenerarse después de una lesión del nervio que el sistema nervioso central, secciones completas inducir encaminamiento erróneo durante el rebrote axonal en particular, después de la cara de la transección del nervio laríngeo. Específicamente, llena la sección del nervio laríngeo recurrente (NLR) induce el rebrote axonal aberrante que resulta en synkinesis de las cuerdas vocales. En este modelo específico, se demostró que el trasplante OECs aumenta eficazmente el recrecimiento axonal. ve_content "> OECs están constituidos de varias subpoblaciones presentes tanto en la mucosa olfativa (OM-OECO) y los bulbos olfativos (Ob-OECO). Presentamos aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de estas diferentes subpoblaciones de OECs en un modelo de lesión del NLR. Utilizando este paradigma, los cultivos primarios de OB-OECs y OM-OECs se trasplantaron en matrigel después de la sección y anastomosis del NLR. Dos meses después de la cirugía, se evaluaron animales trasplantados por análisis complementarios sobre la base de videolarin-goscopia, la electromiografía (EMG) , y los estudios histológicos. Primero, videolarin-goscopia nos permitió evaluar las funciones de la laringe, en particular cocontractions musculares fenómenos. Entonces, EMG analiza riqueza demostrada y sincronización de las actividades musculares. Finalmente, los estudios histológicos basado en azul de toluidina tinción permite la cuantificación del número y perfil de fibras mielinizadas.

Todos juntos, como se describe aquí cómo aislar, cultura, identify y trasplante OECs de OM y OB después NLR sección anastomosis y la forma de evaluar y analizar la eficacia de estas células trasplantadas en las funciones de rebrote y laríngeos axonal.

Introducción

El sistema olfativo principal se compone de dos partes distintas; la mucosa olfativa (OM) en el sistema nervioso periférico y el bulbo olfatorio (OB) en el sistema nervioso central. El sistema olfativo principal se caracteriza por la capacidad de las neuronas olfativas primarios (PON) de auto-renovación durante toda la vida en las especies de mamíferos. Esta capacidad se hace posible debido a la presencia de células madre neurales en la OM. PON crecimiento y la regeneración de la OM de OB se ve facilitada por las células gliales especializadas llamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs son las células de la cresta neural, que crean un microambiente favorable....

Protocolo

1. Los cultivos primarios de la mucosa olfativa y olfativa Bulbos

1. Antes de la disección
   1. Hacer medio, para 50 ml, mediante la adición de 44 ml de libre de calcio de Eagle modificado por Dulbecco / medio de Ham F12 (DMEM/F12), suplementado con 5 ml de suero fetal bovino (FBS) y 1 ml de penicilina / estreptomicina.
   2. Escudo 75 cm ² frascos con poli-L-lisina (50 g / ml, 1,5 mg / cm ^2), 1 hora a temperatura ambiente.
   3. Enjuague frascos con PBS 1x.
   4. Guarde los frascos revestidos en el refrigerador hasta por 1 semana.
2. Disección
   1. Cualquier método de eutanasia debe ser aprobado prev....

Resultados

Ilustraciones con el control y la reinervado (sección / anastomosados) los animales han sido elegidos como los resultados pueden variar dependiendo de los trasplantes celulares realizados (OM, OB o OM + OB).

Cultivo celular
Las células se adhieren rápidamente a la superficie de plástico y se convirtieron en segregado en franjas paralelas de células que son o que se estrecha alargada, triangular, multipolar, o en forma de huso (Figuras 1A y 1B)........

Discusión

Las técnicas presentadas aquí hacen OECs un modelo útil para estudiar los trasplantes celulares en modelos de lesión del nervio periférico. El protocolo de cultivo de células es relativamente sencillo y se puede llevar a cabo fácilmente. Por otro lado, los procedimientos quirúrgicos, en particular la sección / anastomosis del NLR, requieren experiencia y deben ser realizadas por personal cualificado.

Los procedimientos descritos en este protocolo destacan factores importantes para centrarse .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Invitrogen	E3521T
FBS	Invitrogen	E3387M
Penicilina/estreptomicina	Invitrogen	1152-8876
HBSS	Invitrogen	M3467Y
Tripsina-EDTA	Invitrogen	M3513P
Cacodilato	Merck	1.03256.0100
DDSA	Biovalley	00563-450
MNA	Biovalley	00886-450
BDMA	Biovalley	00141-100
Polybed 812	Biovalley	08791-500
PE anti-ratón	BD Bioscience	550589
Matrigel GFR	BD Bioscience	356231
Colagenasa A	Roche	10103586001
Ratón anti P75	Chemicon	MAB 365
11.0 Alambre	Ethicon	FG 2881
Azul de Toluidina	Ral Diagnostics	361590-0025
Centrífuga	Sigma	Sigma 2-16PK
Incubadora	Thermo Scientific
Campana de flujo laminar	Faster	BH-EN 2003 S
Citómetro de flujo	BD Bioscience	FACSCalibur
Microscopio	Zeiss
Videolaringoscopio	Karl Storz Endoskope	Telecam SL NLSC Sistema de
	AD Instruments	Sistema
Sistema de ultramicrotomía Pyramitom	Leica	Ultracut S
	Explora Nova	Mercator

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