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Artículo de método

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

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DOI:

10.3791/50590

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23 de febrero de 2014

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1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

En este artículo

Resumen

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

Resumen

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento y la regeneración de las neuronas olfatorias primarias. De hecho, el sistema olfativo principal se caracteriza por su capacidad para dar lugar a nuevas neuronas, incluso en los animales adultos. Esta habilidad particular, se debe en parte a la presencia de la OECO que crean un microambiente favorable para la neurogénesis. Esta propiedad de OECs se ha utilizado para el trasplante celular, tales como en modelos de lesión de la médula espinal. Aunque el sistema nervioso periférico tiene una mayor capacidad de regenerarse después de una lesión del nervio que el sistema nervioso central, secciones completas inducir encaminamiento erróneo durante el rebrote axonal en particular, después de la cara de la transección del nervio laríngeo. Específicamente, llena la sección del nervio laríngeo recurrente (NLR) induce el rebrote axonal aberrante que resulta en synkinesis de las cuerdas vocales. En este modelo específico, se demostró que el trasplante OECs aumenta eficazmente el recrecimiento axonal. ve_content "> OECs están constituidos de varias subpoblaciones presentes tanto en la mucosa olfativa (OM-OECO) y los bulbos olfativos (Ob-OECO). Presentamos aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de estas diferentes subpoblaciones de OECs en un modelo de lesión del NLR. Utilizando este paradigma, los cultivos primarios de OB-OECs y OM-OECs se trasplantaron en matrigel después de la sección y anastomosis del NLR. Dos meses después de la cirugía, se evaluaron animales trasplantados por análisis complementarios sobre la base de videolarin-goscopia, la electromiografía (EMG) , y los estudios histológicos. Primero, videolarin-goscopia nos permitió evaluar las funciones de la laringe, en particular cocontractions musculares fenómenos. Entonces, EMG analiza riqueza demostrada y sincronización de las actividades musculares. Finalmente, los estudios histológicos basado en azul de toluidina tinción permite la cuantificación del número y perfil de fibras mielinizadas.

Todos juntos, como se describe aquí cómo aislar, cultura, identify y trasplante OECs de OM y OB después NLR sección anastomosis y la forma de evaluar y analizar la eficacia de estas células trasplantadas en las funciones de rebrote y laríngeos axonal.

Introducción

El sistema olfativo principal se compone de dos partes distintas; la mucosa olfativa (OM) en el sistema nervioso periférico y el bulbo olfatorio (OB) en el sistema nervioso central. El sistema olfativo principal se caracteriza por la capacidad de las neuronas olfativas primarios (PON) de auto-renovación durante toda la vida en las especies de mamíferos. Esta capacidad se hace posible debido a la presencia de células madre neurales en la OM. PON crecimiento y la regeneración de la OM de OB se ve facilitada por las células gliales especializadas llamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs son las células de la cresta neural, que crean un microambiente favorable para la neurogénesis del PON de OM a OB 1. De este modo, OECs se puede encontrar en OM y en el OB constituyendo diferentes subpoblaciones de células 2,3. Las diferentes propiedades de la OECO han principales científicos de utilizarlos para trasplantes celulares en varios paradigmas de lesiones del sistema nervioso 4. De hecho, los factores de crecimiento de productos OECs, reducen la cicatrización glial, prregeneración axonal Omote, y puede mezclarse libremente con astrocitos 5,6. Sin embargo, la gran mayoría de estos estudios se basan en la lesión de la médula espinal (SCI); pocos de ellos han utilizado OECs después de la lesión del nervio periférico (PNI) 7,8.

Aunque el sistema nervioso periférico tiene una gran capacidad de regenerarse después de una lesión nerviosa, secciones completas inducir la regeneración axonal aberrante. De hecho, después de transección completa de la cara o de los nervios laríngeos recurrentes (NLR) de los axones mal enrutadas causan cocontractions musculares llamados synkinesis. Por lo tanto, es de importancia primaria a proponer un modelo de PNI no sólo para cuantificar la regeneración axonal, pero también para evaluar la eficacia de las contracciones musculares. En la literatura el modelo más común descrito se basa en 9,10 lesión del nervio facial. En este modelo, las evaluaciones funcionales se basan en la recuperación de los movimientos de la barba 10. Sin embargo, es complicado de demostrar la eficiencia de la movmentos y discriminar los cocontractions fenómenos musculares. Proponemos aquí un modelo basado en una lesión del NLR. Este modelo permite la evaluación no sólo de regeneración axonal y los movimientos de las cuerdas vocales, sino también la eficiencia y la funcionalidad de estos movimientos después de los trasplantes celulares 11,12. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso a la cultura y el trasplante OECs de OM y OB en un modelo de la sección del NLR / anastomosis y evaluar los animales después de la cirugía.

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Protocolo

1. Los cultivos primarios de la mucosa olfativa y olfativa Bulbos

  1. Antes de la disección
    1. Hacer medio, para 50 ml, mediante la adición de 44 ml de libre de calcio de Eagle modificado por Dulbecco / medio de Ham F12 (DMEM/F12), suplementado con 5 ml de suero fetal bovino (FBS) y 1 ml de penicilina / estreptomicina.
    2. Escudo 75 cm 2 frascos con poli-L-lisina (50 g / ml, 1,5 mg / cm 2), 1 hora a temperatura ambiente.
    3. Enjuague frascos con PBS 1x.
    4. Guarde los frascos revestidos en el refrigerador hasta por 1 semana.
  2. Disección
    1. Cualquier método de eutanasia debe ser aprobado previamente por el cuidado de los animales y el uso comité de la institución y llevado a cabo por personal cualificado.
    2. Elija puras ratas como ratas Fischer.
    3. Después de la rata se ha confirmado que han entrado en anestesia profunda con pentobarbital de sodio o de otras formas inyectables de anestesia, tales como ketamina / xilazina, él y R decapitarquítelo de la piel.
    4. Abra el cráneo desde la parte anterior a la parte posterior.
    5. Retire la toma OB cuidado para evitar las meninges.
    6. En la misma rata, abra la sagittaly cavidad nasal.
    7. Eliminar la OM teniendo cuidado de evitar la mucosa respiratoria. Tenga en cuenta que el epitelio OM se puede identificar fácilmente por su color amarillento.
    8. Protocolos más detallados sobre la disección de OM se pueden encontrar en una anterior J. Vis. Exp . publicación 13.
  3. Cultura
    1. Coloque OB en solución de Hank tamponada de sal (HBSS) que contiene 0,1% de tripsina durante 45 min a 37 ° C.
    2. Coloque OM en HBSS que contiene 0,05% de colagenasa A durante 45 min a 37 ° C.
    3. Detener la digestión enzimática mediante la adición de 2 ml de medio caliente.
    4. Lavar las células con medio y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min.
    5. Se tritura muestras de 2ml de medio con una pipeta P1000 hasta que se obtuvo una suspensión celular homogénea.
    6. Placa de las células en los frascos previamente recubiertos (5-10 x 10 6 células / frasco) con 25 ml de medio caliente.
    7. Incubar y cultivar las células a 37 ° C con 5% de CO 2.
    8. Cambiar la mitad del medio cada 2 días.
    9. Después de 6-8 días in vitro, comprobar la proporción de células p75 positivas en muestras de células pequeñas, se supone que es la OECO en roedores, por citometría de flujo o por inmunocitoquímica. Para estos análisis, otros marcadores se pueden estudiar tales como GFAP y S100β.
  4. El análisis de citometría de flujo
    1. Recoger las células como se describe en "El trasplante celular" (sección 2.2).
    2. Incubar con p75 anticuerpo primario (1:100) durante 15 min a 4 ° C.
    3. Lavar las células con 2 ml de PBS-EDTA y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min.
    4. Se incuban las células con PE anti-ratón anticuerpo secundario conjugado durante 15min a 4 ° C en la oscuridad (1:200).
    5. Lavar las células con 2 ml de PBS-EDTA y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min.
    6. Resuspender las células en 500 l de PBS-EDTA.
    7. Analizar 10-30 x 10 3 células con citómetro de flujo.
  5. Análisis de inmunocitoquímica
    1. Placa de las células en placas de 6 pocillos recubiertos previamente durante 48 horas como se describe en la "cultura" (apartado 1.1.2).
    2. Lavar las células con PBS.
    3. Fijar las células con PFA al 4% durante 15 min a TA.
    4. Lavar las células con PBS.
    5. Se incuban las células con PBS / Triton X100 (0.1%) durante 15 min a TA.
    6. Lavar las células con PBS.
    7. Se incuban las células con anticuerpos primarios (1:200): p75, S100β y GFAP durante la noche a 4 ° C.
    8. Lavar las células con PBS.
    9. Se incuban las células con los anticuerpos secundarios (1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
    10. Lavar las células con PBS.
    11. Se incuban las células con Hoechst 10 min a RT en la oscuridad.
    12. Lavar las células con PBS.
    13. Analizar las células usando un microscopio de fluorescencia.
  6. Células de etiquetado GFP
    1. Cinco días antes del trasplante, infectar cultivos de obstetricia y OM durante la noche con vector lentiviral albergar GFP mejorado (multiplicidad de infección: 20).
    2. Ante la comprobación del trasplante en muestras pequeñas, la tasa de células GFP positivas por citometría de flujo como se describe anteriormente en la "cultura" (sección 1.1).

2. Cirugía y Trasplante

  1. Anastomosis del nervio recurrente
    1. Todos los experimentos con animales deben ser aprobados previamente por el cuidado de los animales y el uso comité de la institución y llevados a cabo por personal cualificado.
    2. Antes de la cirugía autoclave todos los instrumentos y mantener la esterilidad durante los procedimientos quirúrgicos.
    3. Anestesie rata mediante inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (12,5 mg / kg) y clorhidrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Evaluar la adecuación de la anestesia por el pellizco del dedo del pie antes de la cirugía.
    4. Coloque la rata en decúbito dorsal.
    5. Realizar una incisión media vertical de 2 cm de cuello uterino cutánea con un escalpelo.
    6. Realice una incisión vertical de los músculos infrahioideos siguiendo la línea blanca medial.
    7. La exposicion laringe utilizando retractor autoestática entre los músculos infrahioideos.
    8. Exponer la NLR.
    9. Bajo control microscópico, cortar el nervio plenamente con micro tijeras a nivel del séptimo anillo traqueal.
    10. Realice anastomosis utilizando un punto de sutura 11.0 bajo control microscópico. Esta cirugía produce una denervación motora específica de la laringe.
  2. Trasplante celular
    1. Justo antes del trasplante, eliminar las células de los platos usando 0,05% de EDTA tripsina durante 5 min a 37 ° C.
    2. Detener la digestión enzimática mediante la adición de 2 ml de medio caliente.
    3. Centrifugar a 300 xg durante 3 min.
    4. Bajo un microscopio contar las células usando un hemocitómetro y ajustar la concentración celular de acuerdo a protocolo específico. En este modelo, las concentraciones deseadas fueron entre 1,2 a 6 x 10 6 células en 30 l de DMEM/F12.
    5. Haga de la preparación celular con 1:02 de mezcla (30 y 60 l en este experimento) de DMEM/F12-Matrige l en un tubo de 1,5 ml antes del injerto y colóquelo sobre hielo. Para evitar los efectos no específicos, utilice el factor de crecimiento reducido Matrigel.
    6. Justo antes del trasplante mantener el tubo en la mano durante unos segundos para calentar la mezcla de Matrigel mediano.
    7. Deponer a la mezcla en el lugar de la anastomosis con una pipeta y espere hasta que la mezcla se auto-ensambla en el nervio lesionado.
    8. Cierre los músculos y la piel con una sutura 4.0.
    9. Casa de las ratas individualmente y mantener bajo una lámpara de calor durante 24 horas.

3. Evaluación

  1. La laringoscopia
    1. Anestesie ratas por intraperitinyección oneal de clorhidrato de ketamina (12,5 mg / kg) y clorhidrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Confirmar ratas se anestesian con una pizca dedo del pie antes de proceder con el protocolo.
    2. Coloque la rata en decúbito dorsal.
    3. Inserte un 30 ° videolaryngoscope ajustadas para proporcionar la mejor vista de la laringe. Determinar puntos de referencia anatómicos para reproducir el mismo punto de vista para cada grabación.
    4. Registre los movimientos de las cuerdas vocales con el videolaryngoscope (5-10 secuencias / animal). Para cada animal seleccionar tres secuencias sucesivas de aducción y abducción máxima máxima.
    5. Analizar la función laríngea el uso de software de análisis de imágenes. Determinar movimiento angular absoluta mediante la medición de la diferencia entre el movimiento de abducción y aducción máxima máxima de las cuerdas vocales. Determine la puntuación dinámico midiendo la amplitud de movimiento. Determine la puntuación funcional midiendo la synkinesis y movimientos paradójicos.
  2. La electromiografía (EMG)
    1. Coloque un electrodo en los músculos isquiotibiales de la rata para el aislamiento eléctrico.
    2. La exposicion laringe y tráquea mediante la apertura de la piel y los músculos, como se describe anteriormente en "anastomosis del nervio recurrente" (sección 2.1).
    3. Exponer el cartílago cricotiroidea.
    4. Abra el cartílago cricotiroidea para exponer la cricoaritenoide posterior (ACP) músculo con micro tijeras.
    5. Introducir un electrodo de aguja monopolar (38 x 0,45 mm) en el músculo PCA.
    6. Registrar la actividad eléctrica muscular del músculo PCA utilizando un sistema de adquisición durante la ventilación espontánea.
    7. Analizar la actividad muscular en términos de riqueza y la sincronización con la respiración. Analizar EMG, asignar una puntuación cualitativa 0-3 utilizando la siguiente escala: 0: el rastreo sin rima, sin aumento durante la inspiración, 1: rimada trazando con inspiración en aumento, pero pobre rastreo (Neurogen), 2: rimada trazando con la actividad más rico, 3: rimada localización, muy rica, lo que constituye un ipatrón nterferenc, similar a una actividad intencional máxima.
    8. Exponer el nervio vago para medir la duración de latencia y potencial. El nervio vago es elegido como el sitio de estimulación del NLR porque puede dañarse durante la estimulación debido a su pequeño tamaño.
    9. Estimular el nervio vago con un electrodo.
    10. Registre las señales eléctricas en el músculo PCA. Medir la latencia y la duración del potencial. Si es posible utilizar un módulo de adquisición para registrar la actividad muscular, la latencia y la duración del potencial como sistema Powerlab.
  3. Histología
    1. La eutanasia a los animales usando sobredosis de pentobarbital.
    2. Retire el muñón distal del NLR bajo control microscópico. La parte distal del NLR se define como la parte entre la anastomosis y la laringe. Tenga en cuenta que es posible encontrar el sitio de la anastomosis varias semanas después de la cirugía debido a que el 11,0 sutura es una sutura absorbible.
    3. Coloque la porción distal del NLR en 2% de glutaraldehído con 0,1 M de fosfato(PH = 7,3) durante 2 horas a 4 ° C.
    4. Orientar cuidadosamente las muestras para realizar cortes coronales.
    5. Lavar las muestras en tampón de fosfato.
    6. Cortar en segmentos más pequeños (3-4 mm de longitud) y posfijo durante 60 min a temperatura ambiente en 1% de cacodilato tamponadas OsO4 y deshidratados con etanol.
    7. Muestras Orient en moldes de silicona y embebido en resinas que consisten en Polybed 812, DDSA y MNA, al que se añadió 2% de acelerador de la BDMA.
    8. Hacer cortes transversales semi-delgadas (-1μm de espesor) utilizando un Sistema Ultramicrotomía Pyramitome.
    9. Teñir con 0,1% de azul de toluidina en tetraborato de sodio al 1% durante 75 segundos a 70 ° C.
    10. Analizar las muestras del NLR con un sistema de análisis de conteo. Contar el número de fibras y medir perfiles de fibras nerviosas mielinizadas mediante la determinación del límite exterior e interior de la vaina de mielina.
  4. Trasplante
    1. Preparar las células para el trasplante y trasplantar las células descritas anteriormenteen "el trasplante celular" (sección 2.2).
    2. Análisis
    3. La eutanasia a los animales usando sobredosis de pentobarbital. Tenga en cuenta que la fijación de los animales se puede realizar utilizando la inyección intracardíaca de PFA 4%.
    4. Retire alrededor de 2 cm de NLR. Utilice partes proximales y distales del NLR.
    5. Fijar la muestra del NLR en nitrógeno líquido.
    6. Almacene las muestras a -80 ° C.
    7. Las muestras cortadas longitudinalmente mediante criostato (10-20 m de espesor).
    8. Analizar las muestras bajo el microscopio fluorescente para detectar células GFP positivas. Tenga en cuenta que el anticuerpo anti-GFP se puede utilizar para aumentar la emisión de fluorescencia y para llevar a cabo costainings.

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Resultados

Ilustraciones con el control y la reinervado (sección / anastomosados) los animales han sido elegidos como los resultados pueden variar dependiendo de los trasplantes celulares realizados (OM, OB o OM + OB).

Cultivo celular
Las células se adhieren rápidamente a la superficie de plástico y se convirtieron en segregado en franjas paralelas de células que son o que se estrecha alargada, triangular, multipolar, o en forma de huso (Figuras 1A y 1B)....

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Discusión

Las técnicas presentadas aquí hacen OECs un modelo útil para estudiar los trasplantes celulares en modelos de lesión del nervio periférico. El protocolo de cultivo de células es relativamente sencillo y se puede llevar a cabo fácilmente. Por otro lado, los procedimientos quirúrgicos, en particular la sección / anastomosis del NLR, requieren experiencia y deben ser realizadas por personal cualificado.

Los procedimientos descritos en este protocolo destacan factores importantes para centrarse ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer ADIR (Aide à domicile aux Insuffisants respiratoires) y Fondation de l'Avenir, por su apoyo financiero y el Dr. Fanie Barnabé-Heider para la edición del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/F12InvitrogenE3521T
FBSInvitrogenE3387M
Penicilina/estreptomicinaInvitrogen1152-8876
HBSSInvitrogenM3467Y
Tripsina-EDTAInvitrogenM3513P
CacodilatoMerck1.03256.0100
DDSABiovalley00563-450
MNABiovalley00886-450
BDMABiovalley00141-100
Polybed 812Biovalley08791-500
PE anti-ratón BD Bioscience550589
Matrigel GFRBD Bioscience356231
Colagenasa ARoche10103586001
Ratón anti P75ChemiconMAB 365
11.0 AlambreEthiconFG 2881
Azul de Toluidina Ral Diagnostics361590-0025
CentrífugaSigmaSigma 2-16PK
Incubadora Thermo Scientific
Campana de flujo laminarFasterBH-EN 2003 S
Citómetro de flujoBD BioscienceFACSCalibur
MicroscopioZeiss
VideolaringoscopioKarl Storz EndoskopeTelecam SL NLSC Sistema de
AD InstrumentsSistema
Sistema de ultramicrotomía Pyramitom LeicaUltracut S
Explora NovaMercator
adquisición 20212120 PowerlabSistema de análisis de imagen

Referencias

  1. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
  2. Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
  3. Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
  4. Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
  5. Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
  6. Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
  7. Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
  8. Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
  9. Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
  10. Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
  11. Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
  12. Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
  13. Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
  14. Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
  15. Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
  16. Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).

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