Artículo de método

La manipulación genética en

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DOI:

10.3791/50598

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12 de julio de 2013

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1Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un método para el uso de tipo I y tipo II Δku80 Cepas de Toxoplasma gondii Para generar de manera eficiente las supresiones de genes dirigidos y reemplazos de genes para el análisis genómico funcional.

Resumen

Manipulación genética dirigida usando recombinación homóloga es el método de elección para el análisis genómico funcional para obtener una vista detallada de la función del gen y el fenotipo (s). El desarrollo de cepas mutantes con deleciones específicas de genes, mutaciones dirigidas, la función de gen, complementados y / o genes etiquetados proporciona estrategias de gran alcance para hacer frente a la función del gen, en particular si estas manipulaciones genéticas pueden ser dirigidos de manera eficiente al locus del gen de interés utilizando la integración mediada por doble cruzar la recombinación homóloga.

Debido a la muy alta tasa de recombinación homóloga, el análisis genómico funcional de Toxoplasma gondii se ha limitado anteriormente por la falta de métodos eficaces para la orientación supresiones de genes y sustituciones de genes de loci genéticos específicos. Recientemente, hemos abolido la principal vía de recombinación homóloga en el tipo I y las cepas de T. tipo II gondii mediante la supresión del gen encodin1,2 g de la proteína KU80. Los Δku80 cepas se comportan normalmente durante bradyzoite etapas (crónica) in vitro e in vivo de taquizoitos (aguda) y y exhiben esencialmente una frecuencia de 100% de la recombinación homóloga. Las cepas Δ Ku80 hacen estudios de genómica funcional factible en el gen individual, así como en la escala de genoma 1-4.

Aquí, se presenta métodos para el uso de cepas de tipo I y tipo II Δku80Δhxgprt para avanzar genes enfoques de orientación en T. gondii. Nosotros describimos métodos eficientes para producir supresiones de genes, reemplazo de genes, y los genes etiquetados por inserción o deleción dirigida de la fosforribosiltransferasa marcador seleccionable hipoxantina-xantina-guanina (HXGPRT). El gen descrito focalización protocolo se puede utilizar en una variedad de maneras en Δku80 cepas para avanzar en el análisis funcional del genoma del parásito y para desarrollar cepas individuales que llevanmúltiple dirigido manipulaciones genéticas. La aplicación de este método genético y ensayos fenotípicos posteriores revelará aspectos fundamentales y únicos de la biología de T. gondii y los patógenos humanos importantes relacionados que causan la malaria (Plasmodium sp.) y criptosporidiosis (Cryptosporidium).

Introducción

Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular obligado común que infecta de manera crónica con frecuencia y una amplia gama de los animales y los seres humanos 5. Se estima que más de 1 billón de seres humanos son actualmente y crónicamente infectado por este patógeno. Además de la importancia de la enfermedad causada por T. infección gondii, la creciente disponibilidad de herramientas experimentales, potentes recursos genómica 6, la facilidad de crecimiento in vitro y excelentes modelos de ratón han hecho T. gondii un modelo de sistema principal para el estudio más amplio de los eucariotas patógenos intracelulares y otros parásitos apicomplexan importantes que causan enfermedades devastadoras como la malaria (Plasmodium sp.) y criptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. Una limitación significativa de Toxoplasma gondii como un organismo modelo ha sido la recuperación ineficaz de la progenie que transportan dirigido manipulaciones genéticas. Este problem en la orientación de genes se debe a una baja frecuencia de recombinación homóloga con respecto a la alta frecuencia de recombinación no homóloga de cepas salvajes de T. gondii incluso cuando extensa homología de ADN se proporciona en moléculas diana de ADN utilizados en los estudios genéticos 2.

Recientemente hemos genéticamente bloqueado la principal vía de recombinación no homóloga en cepas de tipo I y de tipo II Toxoplasma gondii mediante la supresión del gen que codifica la proteína de 1,2 KU80. El tipo I resultante y Δ Ku80 cepas de tipo II exhiben tasas de crecimiento normales, el tamaño y el comportamiento tanto in vitro como in vivo, durante las etapas de taquizoitos y bradyzoite in vitro e in vivo, sin embargo, estas cepas presentan esencialmente una frecuencia de 100% de la recombinación homóloga y esto fenotipo aumenta la probabilidad de aislar rápidamente la progenie deseada de manipulaciones genéticas específicas por varios cientos a varios Thousand veces 1,2,4. Recientes de toda la comunidad el uso de cepas de tipo I y tipo II Δ KU80 ha incrementado significativamente el ritmo, la variedad, así como la tasa de éxito de los enfoques genéticos específicos en T. gondii 1-4,8-13. Aquí se describe un protocolo general para la eliminación dirigida de genes, la sustitución de genes, y el etiquetado de genes en Δ KU80 cepas de T. gondii. Demostramos cómo diseñar y orientar fiable manipulaciones genéticas de genes específicos o loci genéticos en Δ KU80 cepas de Toxoplasma gondii.

Protocolo

1. Gene Targeting eliminar un gen de interés

Este protocolo está diseñado para la generación eficiente de una cepa mutante que tiene una deleción dirigida de genes en un locus genético definido. El T. descrito previamente gondii hipoxantina-xantina-guanina fosforribosiltransferasa marcador seleccionable (HXGPRT) se utiliza en este protocolo para la inserción de marcador de seguro y fiable después de xantina y ácido micofenólico (MPA + X) selección 14-16. Este protocolo utiliza un método validado y rentable para la construcción de moléculas de direccionamiento de ADN basado en la clonación de recombinación de levadura 17,18. Varios protocolos alternativos están disponibles comercialmente para la construcción de moléculas de direccionamiento recombinantes mediante el uso de métodos de clonación de recombinación bacterianas, en métodos de clonación de recombinación in vitro, o fusión de PCR. El protocolo descrito a continuación proporciona la más alta eficiencia global y la fiabilidad de la recuperación de clonado párrafositas que poseen un gen de supresión específica en Δ KU80 cepas de T. gondii.

1.1 Preparación de la focalización de ADN

  1. El acceso ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) para obtener secuencias genómicas para el gen de interés (GOI).

Nota: Las secuencias genómicas se deben obtener a partir de los tipos I, II o III secuencia del genoma en la base de datos ToxoDB que está más cerca de la cepa ser manipulado. Por ejemplo: GT1 para RH y ME49 de Pru.

  1. Diseño superposición cebadores específicos que amplifican el 5 'y 3' flancos dirigidos genómicas del gen de interés (GOI) la incorporación de un 33 pb superposición con la lanzadera vector de levadura pRS416 (o, alternativamente, pRS426) e incorporar un 33 pb superposición con el marcador seleccionable ( HXGPRT) (Figuras 1A-B). Añadir un sitio de enzima de restricción único en cada cebador en ambos extremos de la 5 'unflancos genómicos dirigidos º 3 ', situado entre los 33 pb superposición y la T. secuencia del cebador gondii-específica (s) (Figuras 1A-B).

Nota: A más de 30 pb superposición se requiere para una eficiente levadura recombinación clonación. El 5 'y 3' flancos dirigidos genómicas están diseñados para amplificar fragmentos de ADN específicos entre 800 y 1400 pares de bases que definen una deleción dirigida. Tenga en cuenta que los flancos más cortos reducirán significativamente la eficiencia en la focalización Δ Δ Ku80 hxgprt fondo 2.

  1. Amplificar por PCR el 5 'flanco de destino utilizando los cebadores F1 y R1, y amplificar por PCR el 3' flanco de destino utilizando el cebador F2 y R2 (Figuras 1A-C) a partir de ADN genómico 3. Por separado, amplificar por PCR el gen ~ 2 Kbp HXPGRT incluyendo la asociada 5 'y 3' dhfr regiones flanqueantes de la casete de ADNc pminiHXGPRT HXGPRT 14 utilizando cebadores HXF y HXR(Figuras 1B-C).

Nota: Amplify flancos de destino usando ADN genómico de la cepa parental a ser transfectadas.

Nota: Coloque el marcador HXGPRT en la orientación hacia delante con respecto a la 5 'y 3' ADN de direccionamiento flancos para facilitar posteriores manipulaciones genéticas eficientes, tales como la eliminación selectiva de HXGPRT del locus alterado.

  1. Verificar correctas tamaños de productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa y estimar la concentración de fragmento de ADN utilizando los estándares de gel de agarosa o de otro método para determinar la concentración de ADN.
  2. Generar alícuotas de levadura competentes como se describe en Gietz y Schiestly 17.
  3. Combinar 50 ng de 5 'genómica flanco focalización, 50 ng de 3' flanco focalización genómico, 100 ng de marcador de selección HXGPRT, y 50 ng de vector lanzadera linealizado con H2O estéril para alcanzar un volumen final de 10 -20 l. Transformar levadura competente los tres productos de PCR y la levadura E. coli vector lanzadera para la clonación de recombinación utilizando el protocolo descrito por Gietz y Schiestly 17. Placa de levadura transformada en placas de agar de medio mínimo uracilo-minus y se incuba a 30 ° C durante 2 - 3 días.

Nota: El conjunto ordenado del plásmido, el 5 'flanco de destino, el marcador HXGPRT, y el 3' flanco objetivo se ve facilitada por los de ingeniería 33 pb superposición entre los fragmentos de ADN (Figuras 1A-B) y está mediada por recombinación homóloga en levadura.

  1. Cosecha de levadura mediante la adición de 2 ml de YPAD 2x a las placas de uracilo-minus y raspando suavemente para desalojar colonias sin interrumpir el agar. Centrifugar la solución de levadura durante 5 min a 5000 x g y descartar el sobrenadante.
  2. Resuspender el sedimento de levadura en 250 l de un tampón de resuspensión que contiene ARNasa y añadir 50 - 100 l de unaperlas de vidrio cid-lavados a la solución. Vortex durante 5 min a la velocidad más alta para romper las células de levadura.
  3. Permitir que las perlas de vidrio para asientan en el fondo del tubo y transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf de 2 ml.
  4. Aislar ADN de levadura utilizando un kit de aislamiento de ADN miniprep, resuspendiendo en un volumen final de ~ 100 l.
  5. Mezcle 2 ADN de levadura l (~ 50 ng) con 40 l de DH10B electroporación competente E. coli se mantienen en hielo.
  6. Transferir la solución a un refrigerados 2 mm brecha cubeta de electroporación y las células bacterianas por electroporación a 2,4 kV y 129 Ω.
  7. Células de rescate mediante la adición de 0,8 ml de caldo SOC a cada cubeta y solución de transferencia a un tubo Falcon con tapa a presión de 14 ml. Se incuban las células a 37 ° C en un tambor de rodillo para 40 - 60 min.
  8. Placa E. coli sobre placas de ampicilina + 2XYT (AMP) y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche.
  9. Seleccione ~ 6-8 colonias individuales y crecer en 3 ml 2XYT + AMP durante ~ 16 horas a 37 ° C.
  10. Prepare un 30% de glicerol de stock congelador de cada E. clon coli.
  11. Se aísla el plásmido de E. pΔGOI clones de E. coli utilizando un kit miniprep, resuspendiendo en un volumen final de ~ 100 l.
  12. Validar el pΔGOI usando enzimas de restricción digiere para medir el tamaño de plásmido de ADN y verificar el ADN esperado pΔGOI patrones de bandas.
  13. Finalizar la validación de pΔGOI por secuenciación de ADN de los extremos 5 'y 3' flancos dirigidos genómicas para verificar la secuencia de ADN 100% sobre la base de datos de la secuencia del genoma en http://www.ToxoDB.org .

Nota: Cerca perfecta homología de secuencia es esencial para maximizar la eficiencia de la orientación de genes 3, ya que cada par de bases diferencia constituye un corte correspondiente en la longitud de homología perfecta.

Nota: La secuencia del genoma de la cepa Δku80 tipo II sobre la base de la Pru parental stlluvia no está disponible en este momento. Este trabajo utiliza el II ME49 secuencia del genoma tipo que el genoma sustituto para la cepa de tipo II Δ Ku80. Basado en datos de la secuencia en un número de loci genéticos, se estima que la ME49 genoma y el genoma Pru presentan polimorfismos de un solo nucleótido a una frecuencia de ~ 1 por 10000 nucleótidos, o menos.

  1. Generar> 200 mg de stock pΔGOI inoculando a ~ 250 ml 2XYT + AMP cultivo de una noche con stocks de glicerol a partir de una E. validado coli miniprep clon.
  2. Se aísla el plásmido ADN pΔGOI de la gran cultivo usando un kit de aislamiento de ADN maxiprep, resuspendiendo en un volumen final de ~ 1.000 l.
  3. Repita enzima digestiones de restricción, o la secuenciación del ADN de la pΔGOI maxiprep de ADN para verificar la molécula de ADN de direccionamiento correcto antes de la transfección.
  4. Alineado de ~ 15 pΔGOI mu g en el extremo 5 'utilizando la enzima de restricción único X (RE.X)digest sitio integrado en el 5 'flanco objetivo (fig. 1B).

Nota: Gene focalización en T. gondii requiere un mínimo de ~ 10 g de focalización de ADN para obtener una frecuencia eficiente de focalización eventos en el locus del gen de interés 2.

  1. Validar linealización de pΔGOI y determinar la concentración de ADN por electroforesis en gel de agarosa o un método alternativo.

Nota: Si la digestión con enzimas de restricción en el extremo 5 'flanco no cede linealización completa, el diseñada 3' único sitio de RE.Y resumen se puede utilizar como un sitio alternativo para la linealización de pΔGOI.

Nota: Una molécula de ADN de direccionamiento completamente linealizado es esencial para la exitosa focalización gen por recombinación homóloga en las cepas Δ Ku80.

  1. Se neutraliza la enzima de restricción por incución a 68 ° C durante 15 - 20 min.
  2. Prepare por lo menos 15 g de plásmido linealizado en 100 l de agua estéril H 2 O. Tienda linealizado pΔGOI a -20 ° C hasta el momento de la transfección.

1.2 Preparación de T. parásitos gondii, transfección, selección, subclonación, validación, archivo y mantenimiento de cepas manipuladas genéticamente

Los métodos generales para la cultura y la manipulación de T. gondii en células de fibroblastos de prepucio humano (HFF) se describen 19-21. Las cepas Ku80 hxgprt Δ Δ replican normalmente en un medio de infección del parásito (Medio de Eagle Mínimo Esencial (EMEM) medio de crecimiento suplementado con 1% de suero bovino fetal (FBS) y 1% diluido a partir de una acción antimicótica 100x-Antibiótico) 1,2. Todo el trabajo con Toxoplasma gondii debe realizarse con nivel de bioseguridad 2 procedimientos. El T. gondii RHΔ Ku80 2 parecepa ntal se generó a partir de la cepa hxgprt RHΔ Del Roos Lab 14. El 1 cepa parental PruΔku80 se generó a partir PruΔhxgprt (Pru cepa gniaud BSG-4 22) que contiene un marcador seleccionable integrado de forma estable CAT y una proteína informadora fluorescente verde (GFP) bajo el control de la etapa de bradizoíto específica LDH2 promotor.

  1. Inocular un matraz de 25 cm2 contiene células HFF confluentes con 1 x 10 6 tipo I RH viable Δ Δ KU80 hxgprt parásitos, o inocular dos frascos de 25 cm 2 con 2 x 10 6 viable II Prugniaud tipo (Pru) Δ Δ KU80 hxgprt parásitos.

Nota: parásitos viables se definen como parásitos extracelulares que recién han lisadas a cabo.

Nota: Esta escala proporciona un número suficiente de parásitos viables para los tres experimentos de transfección.

  1. Inspeccione los cultivos infectados Δ Δ Ku80 hxgprt ~ 68-72 horas después de la infección. Verificar la presencia de parásitos viables y ~ 90 - 95% de lisis de células HFF para planificar el momento preciso de la transfección.

Nota: El aislamiento de parásitos recién egressed es esencial para el éxito de este protocolo, ya bajo la viabilidad del parásito abolirá gen de metas de eficiencia.

  1. Agitar parásitos viables en la solución mediante el cierre de la tapa de plug-sello en el matraz de 25 cm2 y agitar vigorosamente el matraz de ida y vuelta para agitar los parásitos fuera de la superficie de crecimiento sin salpicar líquido en el interior de la tapa o el cuello del matraz .

Nota: la cosecha parásito no requiere un protocolo de liberación de la jeringa con aguja para el tipo I otipo II Δ cepas Ku80.

  1. Transferir la solución parásito a una jeringa de 10 ml unido a un soporte de filtro que contiene una membrana de 3 micras y colocar la unidad de filtro en la parte superior de un tubo de 15 ml con tapón de rosca abierto. Filtro de jeringa de los parásitos en el tubo de tapón de rosca de 15 ml.

Nota: Filtrado de los parásitos a través de la membrana elimina las células infectadas y restos celulares.

  1. Determinar la concentración de parásito (formas de taquizoitos por ml) utilizando un hemocitómetro.

Nota: Opcional: Uso de la solución de los parásitos, crear una unidad formadora de placa (PFU) de ensayo 21 que se leerá 7-8 días después para determinar la viabilidad adecuada de los parásitos transfectados (PFU de taquizoíto relación de ≥ 0,2).

  1. Parásitos de pallets para 7 min a 1.400 xg y aspirar el sobrenadante a ~ 0,4 ml sin perturbar el sedimento parásito. Haga girar durante 2 minutos a 1,400 xg y aspirado restante sobrenadante a ~ 0,01 ml sin perturbar el sedimento parásito.
  2. Resuspender el sedimento parásito con un movimiento rápido de la parte inferior del tubo y añadir inmediatamente Cytomix 23 tampón (1.33x concentración) para el parásito de pellets para obtener una concentración de parásitos de 4 - 5 x 10 7 parásitos / ml Cytomix.

Nota: omitir la adición de ATP y glutatión para Cytomix ya que estas adiciones no mejoran la eficiencia de la focalización gen.

  1. Descongele los 100 l alícuota de la linealizado pΔGOI de protocolo 1.1 (paso 26).
  2. Transferir 0,3 ml de la solución Cytomix parásito (~ 1.3 a 1.6 x 10 7 parásitos) a la 100 l de linealizado pΔGOI de protocolo 1.1 (paso 26), y transferir inmediatamente la totalidad de 0,4 ml parásito + pΔGOI mezcla refrigerada a una brecha de 2 mm cubeta de electroporación.
  3. Electroporar los parásitos en el 1,4 kV y 24 Ω.
  4. Rest de la cubeta de transfección a temperatura ambiente durante ~ 5 min a continuación, transferir todo el contenido de la cubeta de la transfección en un matraz de 150 cm 2 que contiene las células HFF confluentes con 30 ml de medio de infección y se incuba el cultivo infectado durante la noche.
  5. Comience selección en ácido micofenólico + xantina (AMP + X) ~ 20 horas después de la transfección (Figura 2A) mediante la sustitución del medio de infección con MPA + X medio de selección (MPA (25 g / ml) y xantina (50 g / ml) en medio de infección).

Nota: No toque la MPA incubación + X frasco de selección.

  1. Estimar el número total de UFP en el AMP + X matraz de selección ~ 8 días después de la transfección mediante la inspección visual de la monocapa. Verifique la presencia de desarrollar zonas UFP y saludable de la infección por microscopía de luz.

Nota: Si las placas no son visibles durante el día 8, mantener la selección y el monitor de signos de infectarde iones ya que las cepas mutantes puede tener una tasa de replicación reducida.

Nota: Los Ku80 Δ Δ cepas de parásitos hxgprt tienen un muy bajo fondo de los acontecimientos nontargeted no deseadas, lo que permite el éxito en el aislamiento de cepas mutantes con bastante severa, pero los defectos de crecimiento no letales. Si un gen es esencial y no puede ser eliminada, la transfección primaria, o posteriormente pasó población de parásitos, puede revelar un fenotipo donde los parásitos dejan de replicar durante la selección como la población tiene agujeros ciegos dirigidos.

  1. Agitar el matraz como en el paso 3 para desalojar parásitos extracelulares de la monocapa [después de placas visibles han desarrollado] para generar una solución parásito. Transferencia de ~ 0,5 ml de la solución de parásito de la AMP + X matraz de selección a un 25 cm 2 AMP + X matraz de selección que contiene células HFF confluentes (designar esta cultura pase 1A).
  2. Desalojar parásitos en el original de 150 cm 2 MPA + X frasco selección ~ 3 días después y la transferencia de ~ 0,5 ml solución parásito a un segundo 25 cm 2 MPA + X frasco de selección que contiene las células confluentes (HFF designar esta cultura pase 1B).
  3. Permitir que las zonas de infección se desarrollen en pase 1A y / o pasan frascos 1B durante aproximadamente 5 días. Verifique visualmente por microscopía de luz que pase 1A y 1B frascos contienen un mínimo de 25 UFP viables con zonas sanas de la infección.
  4. Elija el pase 1A o 1B frasco pase por paso continuado de MPA + X medio de selección en 25 cm 2 frascos. Mantener pasaje bajo + selección MPA X.

Nota: Los parásitos deben ser cultivadas durante un número suficiente de generaciones para eliminar episomas persistentes no integrados de la población antes de la subclonación. No lleve a cabo la subclonación antes de 20 días después de la transfección de tipo I RH Δ Δ hxgprt Ku80, o antes de 25 días después de la transfección para lostipo II Pru Δ Δ KU80 hxgprt parásitos para permitir tiempo suficiente para diluir episomas no integradas 1,2.

  1. Parásitos subclonar en una bandeja de 96 pocillos que contenía células HFF confluentes con MPA + X medio de selección. Preparar una bandeja a una concentración de 1 parásito / pocillo y una segunda bandeja a una concentración de 2 parásitos / pocillo.

Nota: parásitos subclón que han lisadas recientemente (~ 90 - 95% de las células HFF en el matraz de 25 cm 2) para asegurar que los parásitos tienen una alta viabilidad.

Nota: El marco de tiempo óptimo después de la transfección para la subclonación se estableció mediante la medición de la rapidez con que surgen parásitos dirigidos con éxito a una alta frecuencia en la población seleccionada 1.

  1. Siga paso a la población principal de parásitos transfectados en MPA + medio de selección X usando un horario semanal pasaje de infectarun matraz de 25 cm 2 HFF con 10 l de la solución parásito.

Nota: Si clones portadores de la deleción dirigida de genes (knockouts) no se obtienen a partir de la primera subclonación en el paso 18, resubclone los parásitos de la población mantenida continuamente ~ 10 - 12 semanas después de la transfección.

Nota: Una de las razones que una deleción del gen no se obtiene surge de la persistencia episomal de algunos plásmidos pΔGOI. Persistencia episomal se determina por las secuencias contenidas en el 5 'y el 3' flancos dirigidos genómicos y no parece surgir de la HXGPRT elemento genético. Aproximadamente el 5 - 10% de los plásmidos dirigidos exhiben persistencia episomal significativo que requiere un tiempo después de subclonación para permitir que la población de parásitos un número suficiente de tiempos de generación para diluir los episomas persistentes y resolver la población de integrantes principalmente estables.

  1. Puntuación de la bandeja de 96 pocillos 6-7 días después de la subclonación (parásitos de tipo I) o 7-8 días después de la subclonación (parásitos de tipo II) para los pozos que contienen un solo PFU, identificado como una sola zona de la infección en la microscopía de luz en ya sea 40X o 60X de energía. Marque un pequeño punto en la tapa de la bandeja de 96 pocillos para designar la ubicación de la UFP en el pozo.
  2. Mezclar el contenido de cada pocillo que contienen un único UFP usando una pipeta fijado en 50 l (200 l punta) por dirigir el flujo de fluido sobre la UFP para dispersar los parásitos en el pozo.

Nota: La mezcla así acelera la lisis parásito de la monocapa HFF. El tipo I cepas RH lisará el pozo ~ 4 días después de la mezcla, tipo parásitos Pru II se lisar el pozo a 5 días después de la mezcla.

  1. Seleccione una docena de pozos zadas (clones) y cero en la parte inferior de cada uno de estos pozos lisadas utilizando un 0,5-10 l punta de la pipeta y al mismo tiempo elaborar los 6 l de solución de parásito. Transfer el 6 l de solución de parásito a un pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene células HFF confluentes en 1 mL de MPA + X medio de selección.

Nota: Es esencial a la altura de la parte inferior del pozo para mantener la abertura de alojamiento de la punta de la pipeta en constante contacto con los parásitos que viven en el fondo del pozo.

  1. Monitor de la bandeja de 24 pocillos para la lisis de las células HFF.

NOTA: El tipo general I RH parásitos lisará el pozo en el formato de 24 pocillos en ~ 4 días. Tipo II parásitos Pru típicamente lisar el pozo en ~ 5 días.

  1. Transferir 2 l de solución de parásito viable rayado desde el fondo de cada pocillo en el formato de 24 pocillos para el bien correspondiente de una nueva bandeja de 24 pocillos que contenía células confluentes HFF y 1 mL de MPA + X medio de selección por pocillo.

Nota: Todos los parásitos clones y líneas pueden ser continuamente principalcontenida haciendo pasar 2 l de solución de parásitos viables cada 7 días en este formato de bandeja de 24 pocillos.

  1. Verifique que los parásitos se han transferido correctamente a una nueva bandeja de 24 pocillos mediante la inspección visual con microscopía de luz ~ 18 horas después de la aprobación.
  2. Parásitos cosecha de los pozos lisadas de la bandeja de 24 pocillos de la etapa 23 - 24 utilizando ya sea un 1 ml o 10 ml pipeta y transferir la solución parásito a un tubo Eppendorf.
  3. Pellet los parásitos a 1400 x g durante 7 min, se lava una vez en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), y el sedimento de nuevo a 1400 x g durante 3 min.
  4. Aspirar el PBS a partir del sedimento, a continuación, añadir 200 l de PBS al sedimento para volver a suspender los parásitos. Congelar la solución parásito a -80 ° C hasta el aislamiento del ADN.
  5. Aislar ADN del parásito de cada clon utilizando un minikit de aislamiento de ADN de tejido.
  6. Validar la deleción del gen específico (knockout) mediante PCR utilizando los cebadores de validación (Figuras 2A-C). Prueba para laausencia de la región de codificación funcional del gen de interés y el uso de la CxF aguas arriba y aguas abajo CxR cebadores de ADN genómico (Figuras 2A-B) de prueba para la presencia de productos de PCR que abarcan los flancos dirigidos genómicas y HXGPRT para demostrar correcta 5 'y 3 'integración dirigida del gen HXGPRT en el locus del gen suprimido.

Nota: Los cebadores para la validación deben ser únicos para el gen de interés o un resultado falso positivo puede ser obtenido. Diseño de cebadores puede ser validado en http://www.toxodb.org por la voladura secuencias de los cebadores para el genoma (s) para verificar la cebadores son únicos.

  1. Pasaje clones del parásito en un horario semanal como se describe en el paso 24. Una vez que la eliminación selectiva ha sido validado, la selección continua de MPA + X es opcional.
  2. Archivo parásito clones mediante la preparación de las poblaciones para congelar. Parásitos extracelulares de pelletsa partir de células HFF lisadas en un frasco de cultivo de 25 cm 2, eliminar el medio y volver a suspender suavemente parásito sedimento en medio de congelación cultivo celular a una concentración de parásito> 4 x 10 7 parásitos por ml. Transferir alícuotas a crioviales y parásitos almacenar indefinidamente en nitrógeno líquido, o a -80 ° C.

2. Supresión de HXGPRT

Este protocolo está diseñado para eliminar el marcador HXGPRT de su sitio de integración en el genoma de una cepa genéticamente manipulado Δ Ku80. La eliminación de HXGPRT permite la recuperación marcador y la generación de cepas con múltiples manipulaciones genéticas utilizando sólo las selecciones basadas en HXGPRT 1-3. Mientras que el protocolo detallado a continuación se describe el método para volver a dirigirse a un locus para eliminar HXGPRT, debe tenerse en cuenta que la eliminación de HXGPRT en el locus del gen de interés también permite simultánea de re-integración del gen de tipo salvaje (complementation), re-integración de un gen mutante, así como de re-integración de un gen etiquetado (N-o C-terminal de GFP, etiqueta HA, etc,), lo que permite una variedad de manipulaciones genéticas. Los mecanismos de acción 24 y dirigidas a los protocolos que utilizan selecciones de 6 tioxantina se han descrito anteriormente 1-3,15.

2.1 Borrar HXGPRT

  1. Impuestos Especiales el marcador seleccionable HXGPRT de pΔGOI por digestión con RE.Z para cortar en los sitios de enzimas de restricción únicos que flanquean el HXGPRT (Figura 1B).
  2. Verificar la digestión completa del ADN por electroforesis en gel de agarosa. Aislar la mayor de las dos bandas del gel de agarosa.

Nota: La mayor de las dos bandas contiene el plásmido junto con el 5 'y 3' flancos de ADN objetivo, pero no el gen HXGPRT.

  1. Coloque la sección de agarosa que contiene la banda de ADN más grande en una columna layin girog de la plana de gel sobre la membrana. Girar la columna a 13.000 x g durante 4 min a TA. Añadir estéril H 2 O para el flujo a través para llevar el volumen a 100 l.

Nota: Otros métodos comerciales están disponibles para aislar el ADN a partir de agarosa.

  1. Concentrado de ADN por precipitación con EtOH, resuspender el ADN en un volumen final de 18 l H2O estéril
  2. Mezclar 1 l de ADN concentrado con 7 ml de H 2 O, 1 l de tampón de ligación 10x y 1 l de T4 ADN ligasa (5 unidades) y colocar la reacción a 4 ° C durante la noche para generar pΔGOIc (pΔGOIclean) (Figura 3A).

Nota: fragmentos de ADN con extremos de ADN que contienen RE.Z pueden ser diseñados y se incluyen en este paso para crear plásmidos adecuados para las nuevas circunstancias, la integración del gen de tipo salvaje (complementación), dirigido de re-integración de un gen mutante, así como dirigido reintegración de un gen marcado(N-o C-terminal de GFP, etiqueta HA, etc).

  1. Se diluye la reacción 2x con H2O estéril antes de la electroporación.
  2. Transformar pΔGOIc en E. coli como en el protocolo 1.1 para subclonar, aislar, y validar el plásmido de orientación. Entonces linealizar pΔGOIc en preparación para la transfección (consulte los pasos 1.1.11 a 1.1.26).
  3. Repita el protocolo de transfección parásito tal como se describe en el protocolo 1.2 (pasos 1 a 11).

Nota: Antes de realizar los pasos 1 a 8, verificar que la eliminación selectiva de HXGPRT es factible en la cepa mutante. Infect un matraz de 150 cm2 de células HFF confluentes con 1 x 10 6 taquizoítos de la cepa mutante utilizando 6-tioxantina (6TX) medio de selección (200 g / 6TX en medio de infección ml) y colocar el matraz en un ensayo de UFP. Revise el frasco de 8 días después de verificar que no (o muy pocos, <10) PFU son visibles, lo cual es esencial para establecer que el potencialgen cial eficiencia de la focalización será superior a cualquier potencial de reversión espontánea de la cepa mutante a un fenotipo con la reducción de expresión HXGPRT (un fenotipo de resistencia a 6TX).

Nota: Aproximadamente el 5 - 10% de los sitios de integración HXGPRT exhiben una frecuencia significativa y espontánea de la resistencia 6TX a pesar de que el marcador se HXGPRT aún integrado en el sitio diana (ver sección Resultados Representante para la explicación).

  1. Comience selección 6TX ~ 20 horas después de la transfección cambiando el medio en el matraz de 150 cm 2 a 6TX medio de selección.

Nota: No toque el matraz durante ~ 10 días después de la transfección.

  1. Revise el frasco para la formación de PFU en el día 10-12 después de la transfección (parásitos de tipo I) o el día 10 - 16 después de la transfección (parásitos de tipo II).

Nota: Parasites de ser dirigidos por el borrado de HXGPRT no comenzarán a crecer bajo la selección 6TX hasta que se elimina el gen HXGPRT y mRNA y la proteína HXGPRT residual se inactiva.

  1. Agitar el matraz de selección para crear una solución parásito, y la transferencia de 0,5 a 1,0 ml de la solución parásito a un nuevo matraz de 25 cm2 que contiene células HFF confluentes y 5 ml de medio de selección 6TX. Repita la transferencia de las principales 150 cm 2 a los nuevos 25 cm 2 frascos una vez al día durante dos días más.

Nota: un muestreo múltiple aumenta las posibilidades de captura de parásitos específicos viables que han perdido el gen HXGPRT.

  1. Inspeccionar la matraces de 25 cm2 ~ 5 días después de la infección para verificar la presencia de desarrollar UFP con zonas de parásitos replicantes sanos. Elige una o dos matraces que contienen zonas de infección.

Nota: Los parásitos eliminan de la replicación de genes HXGPRT a una tasa de crecimiento normal en la selección 6TX.

  1. Continuar con el paso de los parásitos en el medio de selección 6TX.
  2. Subclone la población de parásitos después de los 25 - 30 días de selección. Configuración de una bandeja de 96 pocillos con 1 ~ parásito / pocillo y otro con ~ 2 parásitos / pocillo.
  3. Preparar ADN del parásito a partir de clones aislados y mantener clones en una cultura formato de 24 pocillos, según el protocolo 1.2 (pasos 19 a 29).
  4. Validar la eliminación de HXGPRT por PCR utilizando la estrategia descrita en las figuras 3A-B.

3. Etiquetado C-terminal de las proteínas

Este protocolo está diseñado para C-terminal de etiquetado de proteínas por la orientación de la etiqueta para la integración a través de doble cruz sobre la recombinación homóloga en el locus genómico del gen usando AMP + X selección 2,4. Este protocolo funciona de manera eficiente debido a que la secuencia 5 'dhfr del HXGPRT marcador es un funcional de la región 3 'sin traducir completamente validado para otros genes 2,4.

3.1 directo de marcado C-terminal de las proteínas en loci genéticos endógenos

  1. Crear focalización pΔGOItag construcción de plásmido de levadura utilizando la clonación de recombinación (Figura 4) y los métodos descritos en el protocolo 1.1. El 5 'genómica flanco focalización contiene los últimos 800 a 1200 pb de la región de codificación (o ADN genómico) de la GOI, excepto el codón de terminación se mueve a una posición 3' de la etiqueta de elección (etiqueta HA, etiqueta Myc, etiqueta His , etc)
  2. Crear la inserción específica de la etiqueta C-terminal en el locus endógeno del gen de la proteína-codificación, siguiendo los pasos de protocolo 1.1 y 1.2 utilizando la estrategia descrita (Figura 4).
  3. Verificar la inserción de la etiqueta C-terminal en el locus del gen endógeno usando una estrategia de PCR.
  4. Cambiar destino el locus del gen utilizando los métodos descritos en el protocolo 1 y protocolo 2 a dElete el marcador seleccionable HXGPRT para crear un locus del gen endógeno regulado precisamente que expresa una proteína marcada. Este protocolo también se recupera el marcador seleccionable HXGPRT que se puede utilizar de nuevo para apuntar a otro locus en la cepa de etiquetado (véase el protocolo 1).

Resultados

Una plantilla detallada se proporciona para la construcción de un plásmido dirigido a eliminar un gen, incluyendo la colocación de sitios de enzimas de restricción y la generación de los cebadores que facilitan la modificación genética dirigida y validación de genes de la orientación, así como la construcción de plásmidos para la posterior eliminación de HXGPRT en un proceso de un solo paso (Figuras 1A-C, Figura 2A, Figura 3A). Un esquemático general que se presenta para la fabricación de una deleción dirigida de genes (Figura 2A), los pares de cebadores utilizados para validar la eliminación de un golpe de gracia, por ejemplo, de tipo I rop18 (Figura 2B), y los resultados representativos de la validación de PCR se muestran (Figura 2C). Este resultado representativo se muestra para ilustrar la gama de resultados que se pueden obtener en los loci genéticos que son relativamente difíciles de destino. Una deleción del gen dirigido con éxito dará lugar a la ausencia del gen de enterés producto de PCR (PCR 1), la presencia de la 3 'flanco focalización genómico (PCR2), y la presencia del marcador seleccionable HXGPRT correctamente integrado entre el 5' y los flancos dirigidos genómicas 3 'que definen la supresión (PCR3 y PCR4) . Los clones 3, 4, 5, 6, 8, 9, y 11 se validan las supresiones de genes específicos (knockouts) donde HXGPRT ha sustituido el GOI (Figura 2C).

Un clon que no contiene una deleción del gen puede ser representado por una variedad de patrones de bandas. Típicamente, un clon sin una deleción del gen será un reflejo de la cepa parental (patrón de los padres) con bandas observadas para la PCR1 y PCR2, pero no para PCR3 o PCR4 como se ha visto para los clones 1 y 2 (Figura 2C). Este "patrón parental" surge de algunos mecanismos potenciales. En ocasiones, las AMP parásitos resistentes seleccionados llevan no integradas episomas persistentes del pΔGOI dirigidos plásmido, y nos cuenta que la selección continua a menudo obliga a los episomaspara integrar. También observamos algunos antecedentes rara en el tipo I Δ cepa Ku80 debido a la integración no intencionado de la pΔGOI focalización plásmido, que contiene un ADNc HXGPRT expresado a través de la DHFR 5 'y 3' los elementos del promotor, ya sea en el locus de DHFR o en el HXGPRT parcialmente suprimido locus de 14. Si bien este raro evento es una integración dirigida, que no era la integración previsto y sirve como un punto clave para recordar en el diseño de cualquier estrategia de sustitución de genes. Homología de ADN mayor de 120 pb realizadas en su pΔGOI orientación plásmido puede proporcionar un sitio alternativo para la recombinación de cepas Δ KU80 2 que pueden dar vuelta un fondo no deseado. En la cepa del tipo II Pru Δ Ku80 este fondo se reduce o inexistente en comparación con el de tipo I debido a que el marcador seleccionable HXGPRT se basa en secuencias de tipo I que tienen polimorfismos de nucleótido en comparación con el ADN de tipo II que sereduce en gran medida esta rara experiencia en experimentos con el tipo II Pru Δ Ku80 tensión 1. Si un locus del gen es esencial (no puede borrarse), o tiene un muy bajo la orientación de genes frecuencia en el locus, o si persiste [NONINTEGRATED] episomas no se eliminan fácilmente por el crecimiento y la selección, este patrón parental dominará el patrón observado en MPA clones resistentes. Alternativamente, la molécula de ADN diana se observa a veces para integrar en sólo el 5 'o 3' genómica flanco focalización y una banda que se observa para ya sea PCR3 o PCR4 (pero no ambos) junto con PCR1 y PCR2 como se ve para el clon 10 (5 "integración) y el clon 7 (3 'integración) (Figura 2C). Estos patrones sugieren la ocurrencia poco frecuente de una sola cruz sobre la integración del plásmido en el locus focalización que integra HXGPRT pero esta integración dirigida, no se elimina el gen de interés. Este patrón (líneas 7 y 10 en la Figura 2C) emphasizes la necesidad de reportar los datos de PCR para verificar la integración dirigida que se produjo en lugar de una sola cruz homóloga más de un segundo y la integración no homóloga de la molécula de direccionamiento. En raras ocasiones, se observa una mezcla genética representada por el clon 12 (Figura 2C) que representa a la vez un patrón de los padres y un patrón de deleción dirigida. Este patrón más probable es que en ocasiones surge a partir de dos genotipos de parásitos que están presentes en el mismo lugar en una de clonación bien.

Se muestra un esquema general para la eliminación de HXGPRT de Δ ku80Δgoi :: HXGPRT para eliminar HXGPRT de la cepa (Figura 3A). El par de cebadores utilizado para validar la eliminación de HXGPRT de Ku80 Δ Δ gra2 :: HXGPRT (Figura 3B) amplifica una banda única ~ 1,2 Kbp en PCR5 como se ve en los clones 4, 7, 9, 11 y 12 (Figura 3C). Si HXGPRT no se elimina de la locus, un ~ 3.Se observa una banda de 4 Kbp (clones 1, 2, 3, 6, 8, 10, y el control parental). Varios mecanismos actúan para hacer que la eliminación de HXGPRT (6TX selección) más difícil y menos eficaz que la integración de HXGPRT (MPA + X de selección). Selección MPA es simplemente más eficiente que 6TX selección 14,16. Además, se necesitan niveles más altos de expresión HXGPRT para la selección 6TX que para selecciones de AMP 16,24. En consecuencia, las mutaciones que pueden reducir la actividad enzimática HXGPRT o mutaciones o cambios epigenéticos que reducen el nivel de expresión de HXGPRT en el locus de un gen potencialmente pueden abolir la eficacia de la selección 6TX. Incluso con estos retos de selección 6TX, la tasa de éxito de la selección 6TX en cepas Δ Ku80 es mayor que 90% en el primer intento 1-3.

Se muestra un esquema general para el etiquetado directo de C-terminal de la proteína-codificación de los genes (Figura 4). Esteesquema utiliza la integración directa a través de doble cruz sobre la recombinación homóloga de HXGPRT 3 'del gen marcado y también emplea estrategias de validación similares a los descritos anteriormente. Cuando un gen se sospecha que es un gen esencial esto puede ser verificado utilizando una segunda transfección con un plásmido aislado de forma independiente focalización ADN. Otros métodos, como los planes para la expresión de genes regulados, están disponibles para comprobar aún más si un gen es esencial 25.

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Figura 1. Descripción general del diseño de un plásmido de ADN de direccionamiento. Una. Esquema para el diseño de superposición cebadores utilizados para amplificar por PCR el 5 'y 3' con los flancos de destino 33 se superpone pb para el vector lanzadera de pRS416 y casete de minigén HXGPRT. Los cebadores representados en el esquema eranutilizado para generar el 5 'y 3' flancos objetivo de pΔROP18 10. B. Estrategia general para el diseño de una molécula de ADN de direccionamiento. La columna vertebral de pΔGOI es el pRS416 vector lanzadera que contiene uracilo (URA) y ampicilina (AMP) marcadores de selección. Insertado en pRS416 es un ~ 1 kbp 5 'del ADN flanco diana amplificado a partir de ADN genómico con superposiciones para el casete de minigén HXGPRT y pRS416 usando los cebadores F1 y R1, un ~ 1 Kbp 3' flanco ADN diana se amplifica a partir de ADN genómico con superposiciones para el casete minigen HXGPRT y pRS416 utilizando los primers F2 y R2 y el casete minigen HXGPRT. Los siguientes sitios de restricción de enzimas digieren únicas se agregan a los cebadores: RE.X (enzima de restricción sitio de corte X) en el cebador F1 para cortar el plásmido en el extremo 5 'de la 5' ADN flanco de destino, en el RE.Y R2 imprimación para cortar el plásmido en 'final de la 3' del ADN de flanco 3 de destino y RE.Z en los cebadores R1 y F2 para escindir el HXGPRT mincasete Igene. C. Primer secuencias utilizadas para generar la construcción de la orientación para la supresión de rop18. Las regiones negrita corresponden a T. secuencia genómica gondii, y las regiones nonbold corresponden a los sitios de enzimas de restricción y las secuencias que se superponen con pRS416 y el casete de minigén HXGPRT. El primer par HX_F y HX_R amplifica el casete minigen HXGPRT 14. Los cebadores leen desde 5 'a 3'. Tabla adaptada de Fentress et al 10. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 2. Descripción general del protocolo para la eliminación de un gen utilizando HXGPRT. Una. Disruption de un GOI en la cepa ku80Δhxgprt Δ por un entrecruzamiento doble evento de recombinación homóloga utilizando un ~ 1 kbp 5 'del ADN diana y un flanco ~ 1 Kbp 3' flanco ADN objetivo en el plásmido pΔGOI. Una estrategia de PCR usando PCR1, PCR2, PCR3, PCR4 y (no a escala) se muestra que permite la verificación genotipo para validar los clones con la integración dirigida de HXGPRT y deleción del locus GOI. B. pares de cebadores representativos diseñada para validar la eliminación de rop18 . ROP18_DF y ROP18_DR amplifican PCR1, ROP18_ExF y ROP18_CxR amplifican PCR2, ROP18_CxF y DHFR_CxR amplifican PCR3 y DHFR_CxF y ROP18_CxR amplificar PCR4 (véase la Figura 2A). Los cebadores leen desde 5 'a 3'. Tabla adaptada de Fentress et al 10. C. Los resultados representativos de la validación de una deleción génica dirigida (rop18) utilizando HXGPRT. Después de la transfección del plásmido pΔROP18 en Δ ku80Δhxgprt y selección de MPA +X, X + AMP clones resistentes se analizaron para la supresión de rop18. El control cepa parental es positivo para la PCR 1 (~ 400 pb) y PCR 2 (~ 650 pb) del producto y negativo para la PCR 3 (~ 1200 pb) y PCR 4 (~ 1300 pb) del producto. Un nocaut GOI objetivo es positivo para los productos PCR2, PCR3 y PCR4 y es negativa para el producto de PCR 1 (véase la Figura 2A). Se muestra son los paneles representativos de los resultados de PCR1 y PCR2 (panel superior), PCR3 (panel medio) y PCR4 (panel inferior). Los clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 y 11 muestran el patrón de bandas correcta de la PCR 1, PCR2, PCR3 y PCR4 que define un evento de deleción dirigida de genes en el clon. Los clones 1, 2, 7, 10 y 12 no son supresiones de genes, y corresponden a otros resultados representativos potenciales. (C = control de la cepa parental Δ ku80Δhxgprt, M = marcadores de tamaño). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 3. Descripción general del protocolo para reorientar el gen de interés para borrar HXGPRT. A. Estrategia para la eliminación del marcador seleccionable HXGPRT por un entrecruzamiento doble evento de recombinación homóloga en la cepa Δ ku80Δgoi :: HXGPRT utilizando un ~ 1 kbp 5 'del ADN diana y un flanco ~ 1 Kbp 3' flanco ADN objetivo en el plásmido pΔGOIc. La estrategia de PCR para la verificación genotipo se representa utilizando un par de cebadores para el ensayo de un producto de PCR (PCR5) que se extiende por la deleción (no a escala). B. Un par de cebadores representante diseñada para validar la eliminación del marcador seleccionable HXGPRT de la gra2 locus en la cepa Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. cebadores gra2 _CLF y GRA2_CxR amplifican PCR5. Primers leer de 5 'a 3' del panel. C. Representante de 6TX clones resistentes que se pueden obtener después de la transfección del plásmido pΔGOIc en Δ ku80Δgoi :: HXGPRT y selección en 6TX. Los clones 4, 7, 9, 11 y 12 exhiben el patrón de bandas correcta de PCR5 que corresponda a la eliminación específica del marcador HXGPRT (~ 1,2 Kbp producto que abarca 'flanco con ligero solapamiento con el 5' de la 3 flanco y fuera de la 3 ' flanco). Los clones 1, 2, 3, 6, 8, y 10 (esta banda es la luz) representan el patrón de bandas esperado de alrededor de ~ 3,4 kbp que se corresponde con el genotipo clon parental, a pesar de que estos clones exhibieron un grado de resistencia a la 6TX que permitieron su selección (este fenotipo puede surgir espontáneamente de vez en cuando por el cierre de expresión HXGPRT (véase la nota en el protocolo 2.1 (paso 8) y la sección de resultados representativos). (C = cepa de control parental Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = marcadores de tamaño).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.

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La Figura 4. Diseño de una molécula de ADN de direccionamiento para etiquetar el extremo C-terminal de una proteína. La estrategia se basa en la capacidad del marcador de HXGPRT a funcionar también como región reguladora aguas abajo de un 3 '. La columna vertebral de pΔGOItag es el pRS416 vector lanzadera que contiene uracilo (URA) y ampicilina (AMP) marcadores de selección. Insertado en pRS416 es un ~ 1 Kbp 5 'DNA flanquean diana amplificado a partir de ADN genómico con solapa de la cinta minigen HXGPRT y pRS416 utilizando el Fgoi y RTAG cebadores, a ~ 1 Kbp 3' DNA flanquean diana se amplifica a partir del ADN genómico con solapa para el casete de minigén HXGPRT y pRS416 usando la F2 y R2cebadores y el casete minigen HXGPRT. El 5 'ADN flanco destino reemplaza el codón de terminación con la etiqueta (HA, Myc, His, etc) seguido de un codón de terminación de reemplazo. AMP + X selección integra la etiqueta C-terminal y un HXGPRT aguas abajo, y mueve el 3 'UTR a una posición tras el marcador HXGPRT. Los siguientes sitios de restricción de enzimas digieren únicas se agregan a los cebadores: RE.X (enzima de restricción sitio de corte X) en el cebador Fgoi para cortar el plásmido en el extremo 5 'de la 5' ADN flanco de destino, y en el RE.Y cebador R2 para cortar el plásmido en 'final de la 3' del ADN de flanco 3 de destino, y en el RE.Z RTAG y los cebadores F2 para escindir el casete de minigén HXGPRT para su uso para la construcción de plásmidos para volver a apuntar el locus del gen etiquetado para eliminar el marcador HXGPRT que restaurará la colocación de la 3 'UTR.

Discusión

Aquí se proporciona un protocolo para génica eficaz focalización en Δ Ku80 cepas de parásitos para permitir la recuperación eficiente de la progenie manipulado genéticamente que poseen deleciones de genes específicos, reemplazos de genes, y / o genes etiquetados. La ejecución secuencial de estos métodos proporciona un enfoque fiable para el aislamiento de mutantes de parásitos que contienen manipulaciones genéticas específicas únicas o múltiples 1-3. Mientras que la generación de una deleción específica depende de múltiples factores, el uso de la cepa Δ Ku80 con la estrategia y el protocolo presentado aumenta en gran medida la eficiencia y la facilidad de hacer cepas mutantes definidos con precisión de T. gondii para estudios de genómica funcional.

El genoma de T. gondii durante las etapas asexuales se haploides. Por lo tanto para hacer una consideración en la planificación para eliminar un gen es el gen que no debe ser esencial in vitro. Sin embargo, la eficiencia de targeting genes knockouts en Δ KU80 cepas es muy alta, lo que permite el aislamiento de cepas mutantes con tasas de repetición discapacidad significativa. Si un gen objetivo es esencial, los parásitos a menudo dejan de repetir durante la selección. Otro factor crítico en la manipulación genética específica es que la homología perfecta con al menos 620 pares de bases del flanco focalización genómico se requiere para obtener integraciones dirigidas detectables 2. Regiones más largas de homología producen una mayor eficiencia de la focalización y el uso dirigido bandas de ADN de aproximadamente 1000 pares de bases es un método fiable y eficiente 1-4. Por esta razón es importante que los flancos dirigidos genómicas se generan a partir de la misma cepa de T. gondii (RH, Pru) como la cepa que está siendo manipulado genéticamente. La falta de suficiente homología puede dar como resultado con frecuencia en la integración dirigida de un flanco orientación genómica, pero no el otro. Integración incompleta o no obtención de un ma knockouty también ser debido a la persistencia episomal. Inmediatamente después de la transfección, todas las moléculas de direccionamiento están NONINTEGRATED episomas, y, a veces moléculas de direccionamiento pueden persistir como episomas para muchas generaciones. Usando objetivo flancos de ADN de ~ 1 Kbp y continuando a pasar parásitos bajo la selección antes de volver a subclonación con frecuencia resuelve los problemas asociados con la persistencia episomal.

Una vez que un golpe de gracia se valida y se elimina el marcador HXGPRT, la estrategia de selección de genes se puede repetir en una segunda GOI para generar supresiones de genes múltiples en una sola cepa del parásito 1-3. La generación de deleciones, sustituciones, o genes etiquetados también se puede lograr mediante el uso de diferentes marcadores de selección (bleomicina, CAT, pirimetamina resistente DHFR, etc). Aunque el marcador seleccionable CAT Actualmente está presente en el tipo II Δ Ku80 Pru genoma 1, este marcador se puede eliminar mediante el HXGPRT protocolo de selección descritos aquí. También En nuestras manos, la selección HXGPRT es el más seguro y el marcador más eficiente con la más alta eficiencia selección del objetivo, una única copia de inserción dirigida es suficiente para la selección robusta en AMP + X medio. HXGPRT proporciona actualmente el único enfoque útil para deleción dirigida de un marcador de selección (Figura 3) usando 6-tioxantina (6TX) selección 2,3. Así, este protocolo ofrece el único enfoque actual para el desarrollo de cepas mutantes definidos con varias manipulaciones genéticas específicas.

Este protocolo proporciona un método valioso y eficiente para la manipulación genética específica en Ku80 Δ cepas de Toxoplasma gondii y es aplicable al análisis de un solo gen, una familia de genes, o estudios de genómica funcional en todo el genoma. Antes de la disponibilidad de las cepas Ku80 Δ 1,2, estos enfoques no eran ampliamente factible debido a la ineFficiency de estos métodos. Por lo tanto, este protocolo es ampliamente aplicable para la manipulación genética dirigida de Toxoplasma gondii y es accesible a todos los investigadores interesados ​​en el tratamiento de una serie de preguntas sobre la biología del parásito, respuesta del huésped, y la genómica funcional.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH a DJB (AI041930, AI073142, AI075931 y AI091461).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Imprimadores superpuestosTecnologías de ADN integradas Oligosde ADN ultramero de 4 nmole
CebadoresADN integradasOligo de ADN de 100 nmole
Cepa de levadura #90845Designación ATCCFY834
Vector de lanzadera pRS416ATCC87521
DH10B E. coliInvitrogen12033-015Caldo SOC en kit con E. coli
Tampón de resuspensiónQiagenTampón P1 en QIAprep Spin Miniprep Kit Miniprep
Kit MiniprepQiagen27104QIAprep Spin Miniprep Kit
Cuentas de vidrioScientific IndustriesSI-BG050,5 mm lavado con ácido
Qiacube Estación de trabajo robótica automatizadaQiagen
Cubeta de electroporaciónUSA Scientific9104-5050mm-gap
BTX600 electroporadorBTX
Maxiprep KitQiagen12662QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Matraz de sellado de tapón de cuello inclinadoCorning430168
150 cm2 Matraz de sellado de tapón de cuello inclinadoCorning430823
Prepucio humano Células de fibroblastos (HFF)ATCCSCRC1041
Swin-lok PortafiltrosWhatman420200Membrana de 25 mm de diámetro
Whatman110612Nucleopore Membrana grabada con trazas Tamaño de poro de 3 mm, 25 mm de diámetro
Ácido micofenólico (MPA)Sigma
Xantina (X)Sigma
Bandeja de cultivo de tejidos de 96 pocillosCorning Costar
Bandeja de cultivo de tejidos de 24 pocillosCorning Costar
MEM Eagle MediaLonza Biowhittaker12-611F
Suero fetal bovinoGibco26140-111
Antibiótico-Antimicótico (Anti-Anti)Gibco15240-062
Columna de centrifugadoPrimm LabsPAE-100Kit de centrifugado de extracción de ADN fácil de limpiar
T4 ADN ligasaNew England Biolabs
6-tioxantinaAcros Organics
Tissue DNA MinikitQiagen51104QIAamp DNA Blood Mini Kit
Medios de congelación/recuperación de cultivos celularesGibco126-48-010
Hibona salina tamponada con fosfatoSH30028.02menos calcio, menos magensio
de validación Tecnologías de 2

Referencias

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