La captura simultánea imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión mediante un sistema de división de doble cámara de emisiones: Las solicitudes de adhesión de células

Summary

Sistemas que dividen las emisiones de cámara dual para dos colores microscopía de fluorescencia generan secuencias de imágenes en tiempo real con una resolución óptica excepcional y temporal, una exigencia de ciertos ensayos de células en vivo, incluyendo ensayos de adhesión cámara de flujo de placas paralelas. Cuando se emplea software para fusionar las imágenes de los canales de emisión adquiridos simultáneamente, se producen secuencias de imágenes pseudocoloreada.

Abstract

Multi-color de inmunofluorescencia microscopía para detectar moléculas específicas en la membrana celular se puede acoplar con ensayos de cámara de flujo de placas paralelas para investigar los mecanismos que regulan la adhesión celular en condiciones de flujo dinámico. Por ejemplo, las células cancerosas etiquetado con múltiples fluoróforos pueden ser perfundidos sobre un sustrato potencialmente reactivo para modelar los mecanismos de la metástasis del cáncer. Sin embargo, los sistemas de cámara única de múltiples canales y cámaras de color presentan deficiencias en la adquisición de imágenes para el análisis de células vivas en tiempo real. Para superar estas limitaciones, se utilizó un sistema de división de las emisiones de doble cámara para capturar simultáneamente secuencias de imágenes en tiempo real de las células marcadas con fluorescencia en la cámara de flujo. Longitud de onda de emisión de la división de sistemas de filtro de la cámara dual definido oscila en dos cámaras CCD monocromo, capturando con ello simultáneamente dos imágenes idénticas pero espacialmente fluoróforo específico. Posteriormente, psuedocolored imágenes de un canal se combinan en un soloen tiempo real se fusionó secuencia que puede revelar múltiples moléculas diana en las células que se mueve rápidamente a través de una región de interés.

Introduction

Métodos para el análisis de moléculas en la superficie celular, tales como la inmunotinción, emplean sondas que se conjugan químicamente a fluoróforos, que permite la detección de moléculas diana. Imágenes de células en vivo y ensayos de adhesión celular basados ​​en el flujo hidrodinámico se registran de cámaras CCD monocromo diseñadas para capturar los procesos fisiológicos a nivel celular y / o molecular de nivel ^{1, 2.} Estas cámaras son muy sensibles, entregar velocidades de cuadro rápidas (más de 30 cuadros por segundo), y proporciona una resolución temporal excepcional (debido a velocidades de cuadro rápidas y tiempos de exposición cortos). Sin embargo, las cámaras monocromas sólo pueden capturar un solo canal de emisión (la detección de un solo fluoróforo) para recoger imágenes. Sistemas individuales de división de emisión de la cámara se pueden incorporar para capturar múltiples canales de emisión, pero a menudo reducen el campo de visión y requieren el mismo tiempo de exposición para obtener imágenes de todos los canales. Para capturar el espectro de color de las células marcadas con multíparaLe fluoróforos, una cámara de color se puede utilizar como una alternativa. Sin embargo, las cámaras en color generalmente no son capaces de proporcionar la resolución temporal deseado para imágenes de células vivas en ciertas aplicaciones. Se necesita otro dispositivo de formación de imágenes para aplicaciones en las que es ventajosa para las células vivas de la imagen en múltiples longitudes de onda al tiempo que conserva una alta resolución temporal. Una aplicación experimental principal es el ensayo de adhesión cámara de flujo de placas paralelas, en el que las células se sometieron a perfusión en condiciones fisiológicamente relevantes sobre un sustrato potencialmente reactivo ^{1, 3.} Las células en el flujo que expresan moléculas de superficie celular específicos pueden adherirse y rodillo sobre el sustrato, tal como una monocapa de células que expresan moléculas de adhesión o las proteínas de la matriz extracelular adsorbido en la superficie ^{4, 5.} Células rodantes pueden experimentar el movimiento de rotación y traslación en fracciones de segundo. Características moleculares en la rodadura y las células adherentes, tales como grupos de moléculas de superficie celular, también tienen el potenciómetroAl someterse a la reorganización activa en la superficie celular. Por lo tanto, los sistemas de imágenes deben proporcionar una resolución temporal excepcional (30 cuadros por segundo o superior y "cerca de cero" tiempos de exposición) para generar una secuencia de imágenes que ilustra la progresión paso a paso de la celda de rodadura ^{6, 7.} Sistemas que dividen las emisiones cámara dual son capaces de satisfacer estas demandas de imágenes de células marcadas con múltiples fluoróforos.

Sistemas de división de emisión dual de la cámara se separaron y canales de fluorescencia del filtro en dos cámaras similares para capturar simultáneamente dos imágenes espacialmente idénticos pero fluoróforo específica al tiempo que conserva el campo de visión completo. Esta tecnología permite la comparación directa de la imagen capturada en tiempo real en cada canal y permite al usuario cambiar rápidamente entre los modelos de cámara con diferentes capacidades de imagen. Esta característica es útil para realizar ajustes en la configuración de captura de imágenes en una cámara que mejor permitir que el sistema para capturarfluoróforos con diferentes intensidades, tiempos de vida, y los coeficientes de extinción ^8. Junto con el software de imágenes, sistemas de división de emisión de cámaras duales permiten la grabación en tiempo real de análisis de imágenes de células vivas en múltiples longitudes de onda y pueden mejorar los ensayos in vitro que utilizan la fluorescencia para estudiar el comportamiento celular.

Protocol

1. Instalación del software

1. Compra StreamPix 5 Software multi-cámara con el módulo SimulPix u otro software de imagen capaz de recoger y combinar las imágenes captadas por las cámaras CCD monocromo.
2. Requisitos mínimos para StreamPix 5 incluyen: un PC equipado con Core 2 Duo con 2.4 GHz o superior con 2 GB de RAM o superior. Una cámara digital o analógico IEEE apoyado y capturadora compatible. Ventanas XP/7/Vista 32 o 64 bits. Un monitor de apoyo a la resolución 1024 x 768 o superior. (Se recomienda la OCU expresar 16x o superior) Un adaptador gráfico con un buen rendimiento en 2D y 7.200 rpm unidad de disco duro para la grabación con la configuración de RAID-O.

2. La instalación del sistema de cámara dual Capaz de dos tiempos de Real Color simultánea de imágenes

1. Conecte el divisor DC2 Fotometría de emisión, o un dispositivo de doble cámara de separación de emisiones similar al microscopio deslizando el adaptador DC2 montaje C en el puerto de vídeo de la microscope de tal manera que la carcasa de la dicroico en el dispositivo es accesible.
2. Inserte dos cámaras CCD monocromo en hembra de montura C 1 y C hembra de montaje 2. Cámaras idénticas son preferibles. Cámaras similares pueden ser utilizados, pero la compatibilidad depende de hardware interno, lo más importante es el sensor de imagen CCD.
3. Utilice el software de imágenes para mostrar las imágenes de ambas cámaras. Los pasos siguientes (2.3.1 - 2.3.4) se aplican a StreamPix 5 con el módulo SimulPix y deben ser adaptados para otras aplicaciones de imagen multi-cámara.
   1. Abrir StreamPix 5 y seleccione "espacio de trabajo" en la cinta de tarea.
   2. Abrir "gerente de área de trabajo" que se encuentra en el extremo derecho de la pantalla y seleccione "nuevo espacio de trabajo".
   3. Después de nombrar una cámara, siga software pide que seleccione un capturador de una lista pre-pobladas. Seleccione el capturador de que coincida con el modelo de la cámara y repita para el segundo espacio de trabajo de la cámara. Para el espacio de trabajo resultante de la fusión, se repiten una vez más, pero "todas las cámaras están en uso" error mensaje aparecerá. Este mensaje es normal.
   4. Una vez cargado el espacio de trabajo resultante de la fusión, asignar cámaras del espacio de trabajo y espacio de trabajo 1 2 para el espacio de trabajo resultante de la fusión en el panel de conexión se encuentra en la parte derecha de la pantalla de visualización.
4. Alinear las cámaras en el sistema de división de la emisión de la cámara dual.
   1. Alinear las cámaras en campo claro o de contraste de fase con la red de calibración proporcionado por el fabricante usando un objetivo 40X PlanApo (o mayor).
   2. Enviar luz a los oculares del microscopio, coloque la rejilla de calibración metálico recubierto que fue proporcionado por el fabricante en la platina del microscopio, y cuadrar la cuadrícula en la platina del microscopio.
   3. Traiga la red en el foco.
   4. Plegar, pero no quite, el alojamiento dicroico para alinear la cámara 1 (cámara de derivación). Visualizar la cuadrícula sin hurgar en la basura y sin autoescala. Enfoque la imagen con el dial de ajuste de enfoque en el puerto de montaje C 1.
   5. Empuje la carcasa dicroica en el doble channel dispositivo de adquisición totalmente, de modo que la imagen se divide por la dicroico a ambas cámaras.
   6. Afloje los tres 5/64 "tornillos de fijación y gire la segunda cámara en la hembra de montaje en C 2 hasta que la orientación de la red es idéntica en ambas imágenes. Utilización del dial de ajuste de enfoque en la C-mount puerto 2, llevar la imagen de la cámara 2 en el foco.
   7. Finalizar la alineación utilizando la imagen combinada en el área de trabajo resultante de la fusión del software de imágenes. Esto permite ver una superposición de pseudocolor de tiempo real de las dos imágenes de la cuadrícula de calibración. Ajustar las posiciones de la imagen combinados utilizando sólo el mando de R / L en el lado derecho de la DC2. Ajuste este mando hasta límite vertical derecha / izquierda de la imagen se alinea con precisión.
   8. Utilice el mando U / D para ajustar la alineación de arriba / abajo de la segunda imagen hasta que las barras horizontales de la cuadrícula están correctamente alineados.
   9. Si durante el alineamiento hacia arriba / abajo una ligera rotación de la cámara se produce, corregir este problema, aflojando los tres 5/64 "scre pulgadasws para la cámara 2 y gire hasta que la imagen visualizada esté correctamente alineada.

3. Preparación de las células de cáncer de placas paralelas de flujo Cámara de ensayo de adhesión

1. Cultura BT-20 células de cáncer de mama en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con medio completo con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C y 5,0% de CO ₂ como se ha descrito previamente ^2.
2. Las células cancerosas de la cosecha con un tratamiento de tripsina diluida y cuentan las células con un hemocitómetro.
3. Lavar y suspender las células en 10 ⁷ células / ml en 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) en DPBS con calcio y magnesio (DPBS +).
4. Diluir anticuerpos primarios de ratón purificada, CD24 anti-humano y de rata purificada HECA-452 (antígenos anti-sialofucosylated), a una concentración óptima predeterminada en 0,1% de BSA DPBS +. Se incuban las células durante 30 min ^{9, 10.}
5. Centrifugar las células a 1200 rpm para obtener un sedimento celular. Aspitasa de anticuerpos primaria, y lavar las células dos veces con 0,1% de BSA + DBP.
6. Diluir los anticuerpos secundarios, de cabra anti-IgG de ratón AlexaFluor 568 (emisión máx, 603 nm), y de cabra anti-IgM de rata AlexaFluor 488 (emisión máx, 519 nm), a una concentración óptima predeterminada en 0,1% de BSA DPBS +. Se incuban las células durante 30 min.
7. Lavar las células dos veces y suspender en 0,1% BSA DPBS + a 10 ⁶ células / ml en 0,1% BSA DPBS +.

4. Preparación del Reactivo Sustrato para placas paralelas de flujo Cámara de ensayo de adhesión

1. Conectar dos longitudes separadas de tubo a los puertos de entrada y salida de la cámara de flujo de placas paralelas que se ajusta dentro de una 35 mm de placa de cultivo de tejido. Un tubo se conectará al depósito de células marcadas en suspensión en 0,1% de BSA DPBS + y el otro a la bomba de jeringa, que extraer fluido a un caudal especificado.
2. Conecte una línea de vacío a la cámara de flujo ^1.
3. Coloque la cámara de flujo sobre el 35 mm de cultivo de tejidos diSH que contiene una monocapa de células de ovario de hámster chino que expresan E-selectina (CHO-E). Células CHO-E fueron cultivadas en medio MEM completo a 37 ° C y 5,0% de CO ₂ ^2.
4. Ajustar la cámara de flujo y / o la junta cámara de flujo para asegurar una adecuada sello de vacío ^1.
5. Retirar el fluido del depósito, el seguimiento conjunto de la cámara de flujo para sellado adecuado y no hay evidencia visual de la formación de burbujas de aire ^1.
6. Coloque el conjunto de la cámara de flujo en el microscopio (Leica DMI 6000B) ^1.

5. Dos colores de Adquisición de imágenes

1. Energía de una fuente de luz compacta Leica EL-6000, o un dispositivo similar, para generar luz de alta intensidad y la pareja en una guía de luz. Utilice un microscopio invertido para pasar esta luz a través de un filtro de combinación de cubo, es decir, G / R (verde / rojo) de cubo de filtro, para excitar los fluoróforos de un color / intensidad deseada.
2. Asegúrese de dicroico vivienda está en la posición correcta de funcionamiento (deprimido) yno es en modo bypass.
3. Opere microscopio en modo de fluorescencia y seleccione apropiada filtro de cubo de fluorescencia (verde / rojo).
4. Determinar el tiempo de exposición y ganancia en la cámara 1 (roja; 620 ± 60 nm) y cámara de 2 (verde; 535 ± 40 nm).
   1. Presione el dicroico para obtener imágenes tanto en los canales de emisión de color rojo y verde. Utilice un ensayo de cámara de flujo con células marcadas con sólo el fluoróforo rojo, y obtener una imagen en el canal rojo, ajustando el tiempo de exposición de la cámara 1 en "Ajustes en vivo" del software de imágenes.
   2. Coincidir con el tiempo de exposición de la cámara 2 para el tiempo de exposición de la cámara 1. Si se observa una imagen en el canal verde, los artefactos de purga a través están presentes y el tiempo de exposición en ambas cámaras debe ser reducida.
   3. Mantener el tiempo de exposición equivalente en la cámara 1 y cámara 2, reducir el tiempo de exposición hasta que el artefacto de purga a través ya no es visible en el canal verde. Ajuste la ganancia de la cámara 1 para mejorar la imagen visibilitY en el canal rojo si es necesario.
   4. Repetir los pasos 5.4.1 - 5.4.3 con células marcadas con sólo el fluoróforo verde, pero definir el tiempo de exposición con la cámara 2 a las células de imagen en el canal verde y sin artefactos de purga a través de en el canal rojo recogido por la cámara 1.
   5. Anticuerpos Retitrate si artefactos sangrar a través no pueden ser eliminadas ^11, o si el tiempo de exposición de la cámara 1 y cámara de 2 son sustancialmente diferentes de tal manera que se fusionaron las imágenes pueden ser temporalmente desalineado.
5. Utilice el software de imágenes para ver las imágenes capturadas al mismo tiempo de dos cámaras CCD monocromo en el experimento de la cámara de flujo.
6. Combinar imágenes recogidas de las dos cámaras que utilizan el módulo SimulPix de StreamPix 5 o un paquete de software alternativo.
7. Utilice ajustes de corrección digitales en SimulPix o software alternativo para alinear espacialmente las imágenes fusionadas, si es necesario. Las imágenes pueden ser corregidos con el módulo SimulPix de horizontal, vertical, y regulación de la rotación.

Results

Un ensayo de adhesión cámara de flujo de placas paralelas se utilizó para demostrar un sistema de división de emisiones de doble cámara que captura simultáneamente secuencias de imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión (Figura 1). El sistema de fraccionamiento de emisiones de doble cámara detecta BT-20 células que se marcado con fluorescencia con CD24 anti-humano y HECA-452 (detección de antígenos sialofucosylated) anticuerpos monoclonales y anticuerpos secundarios apropiados (Figur...

Discussion

El sistema de fraccionamiento de emisiones de doble cámara tiene la resolución espacial, temporal y óptica necesaria para capturar imágenes de alta calidad en aplicaciones en las células o el movimiento molecular es rápida. En la generación de los resultados representativos, los parámetros del sistema de división de la emisión de la cámara dual, incluida la configuración de software y configuración de la cámara, fueron optimizados para obtener una secuencia de imagen combinada en el que a la rodadura y las células adher...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo/Material
Células BT-20	ATCC	Células HTB-19
CHO-E Regalo	del Dr. R. Sackstein (Brigham and Women' s Hospital, Facultad de Medicina de Harvard)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicilina-estreptomicina	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Tripsina / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 anticuerpo monoclonal	BD Biosciences	555946
Anticuerpo monoclonal CD24 humano	BD Biosciences	555426
IgM anti-rata AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
IgG anti-ratón AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
Equipment
EXi Microscopía de fluorescencia azul Cámara CCD digital	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Cámara CCD digital	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Divisor de emisiones	fotométrico	DC2
Microscopio de fluorescencia invertida	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix