Permeabilización de células adheridas Usando un gas inerte Jet

Resumen

Este protocolo describe un método para la permeabilización temporal de células adherentes utilizando un chorro de gas inerte. Esta técnica facilita la transferencia de material genético y biomoléculas en células de mamífero adherentes por la utilización de fuerzas mecánicas para romper la membrana de plasma.

Resumen

Existen diversas técnicas de transfección de células y éstas se pueden dividir tres grandes categorías: viral, químicas y mecánicas. Este protocolo describe un método mecánico para permeabilizar temporalmente las células adherentes utilizando un chorro de gas inerte que puede facilitar la transferencia de macromoléculas normalmente no permeables a las células. Creemos que esta técnica funciona impartiendo fuerzas de cizallamiento en la membrana plasmática de las células adherentes, resultando en la formación temporal de microporos. Una vez que se crean estos poros, las células son entonces permeable al material genético y otras biomoléculas. Las fuerzas mecánicas que intervienen no corren el riesgo de dañar permanentemente las células o se separe de su sustrato. No es, por lo tanto, una estrecha gama de dinámica de gases inertes donde la técnica es eficaz. Un chorro de gas inerte se ha demostrado su eficacia en la permeabilización de diversas líneas de células adherentes, incluidos HeLa, HEK293 y células endoteliales de aorta abdominal humanos. Este protocolo es apropiado para el permeabilization de células adherentes, tanto in vitro y, como hemos demostrado, in vivo, demostrando que puede ser utilizado para la investigación y, potencialmente, en futuras aplicaciones clínicas. También tiene la ventaja de permeabilización de las células de una manera espacialmente restrictiva, lo que podría llegar a ser una valiosa herramienta de investigación.

Introducción

Con la evolución de la biomedicina y la comprensión de la mecánica de células, la entrega de las biomoléculas en células se ha convertido en vital para muchos campos de investigación y las terapias médicas. Diferentes técnicas han sido desarrollados para introducir moléculas extrañas a través de la membrana plasmática y en el citosol de la célula. Estos se pueden clasificar en general ya sea como: técnicas viral, químicos o mecánicos. Técnicas virales pueden transfectar material genético, tales como ARN y ADN utilizando vectores virales ^1. Técnicas virales tienden a tener altos rendimientos en ciertas líneas celulares, sin embargo tienen la posibilidad de ....

Protocolo

1. Desarrollo del programa de LabVIEW

1. Un controlador de flujo másico (MKS M100B misa-Flo Controlador) está unido a la línea de gas de helio para garantizar una velocidad de flujo de gas precisa. Esta unidad es controlada por una tensión de entrada, que oscila entre 0 y 5 V. Un bucle de control en el programa LabView determina el voltaje requerido en cualquier momento dado. Interfaz entre el ordenador y el controlador de flujo de masa se lleva a cabo por un dispositivo de adquisición de datos (NI USB-6009), y una fuente de alimentación de 12 V suministra potencia al controlador de flujo másico.
2. Dos diapositivas lineal de posicionamiento se utiliza....

Resultados

La permeabilización de las células HeLa con 10 kDa de dextrano fluorescente verde usando un chorro de gas helio con un capilar de diámetro interior 0,86 mm se muestra en la Figura 1. Las células fueron counterstained inmediatamente después de la permeabilización con 2 l / ml EthD-1 solución (LIVE / DEAD viabilidad / citotoxicidad Kit) para visualizar la muerte celular. Inmediatamente después de la contratinción, cubreobjetos fueron montados y la imagen. Esta figura muestra los resultados de ejecutar el .......

Discusión

Permeabilización chorro de gas inerte es una técnica útil para la transfección de células adherentes. Se proporciona la capacidad de transferir biomoléculas en células con el uso de fuerzas mecánicas, lo que elimina la necesidad de productos químicos potencialmente dañinos o vectores virales. La técnica podría potencialmente dar a los investigadores y los clínicos de una manera eficiente y relativamente sencillo para transfectar células con precisión. La selectividad de la permeabilización también es único permitiendo a.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Proteína fluorescente verde para experimentos de transfección en células HeLa
Dextrano, AlexaFluor 488; 10.000 MW, Aniónico, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextrano para experimentos de permeabilización VIVO/
MUERTO Kit de viabilidad/citotoxicidad Life	Technologies Inc.	L3224	para la contratinción de células de mamíferos
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	para el montaje de portaobjetos al obtener imágenes
helio de ultra alta pureza	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ Medios con alto contenido de glucosa - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	para células HeLa
Suero fetal bovino	Invitrogen	26140079	Para medios DMEM
Penicilina-Estreptomicina, líquido	Invitrogen	15140-122	Para medios DMEM
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x			Producido en laboratorio
			Tabla 1. Lista de reactivos requeridos
Microplacas tratadas con TC transparentes de 6 pocillos	Corning	3506
#1 22 x 22 Cubreobjetos	Fisher	12-542B
Capilares de vidrio	World Precision Instruments		Información de tamaño WPI
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Pedido #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Controlador Mass-Flo	MKS	M100B01314CS1BV	Controlador de flujo másico, serie M100B, requiere una fuente de alimentación externa de 12 V
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
Ensamblaje UniSlide con motor paso a paso y controlador	Velmex		Dos conjuntos UniSlide de la serie MA15, equipados con motores paso a paso Vexta de 1.8 grados proporcionados por Velmex, y controlados por un controlador de motor paso a paso VXM
			Tabla 2. Lista de equipos necesarios

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