Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

Resumen

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Resumen

El sistema nervioso se describe a menudo como un componente de cableado del cuerpo a pesar de que es un sistema de órgano considerablemente líquido que reacciona a los estímulos externos en una manera estereotipada coherente, mientras que se mantiene la flexibilidad y plasticidad increíble. A diferencia del sistema nervioso central (SNC), el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación significativa, pero sólo han comenzado a comprender los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso del pez cebra como modelo de sistema, tenemos la oportunidad sin precedentes de estudios de regeneración con par de imágenes in vivo y la manipulación genética. Los nervios periféricos se componen de los axones rodeados por capas de células gliales y el tejido conectivo. Los axones se envainado por myelinating o no myelinating células de Schwann, que son a su vez envuelto en un fascículo por una vaina celular llamado el perineuro. Después de una lesión, los nervios periféricos adultos tienen la notable capacidad de remoHe dañado restos axonal y objetivos re-inervan. Para investigar las funciones de todos los glía periférica en PNS la regeneración, como se describe aquí un ensayo de transección axón que utiliza un láser de colorante bombeado por nitrógeno disponible en el mercado a axotomize nervios motores en el pez cebra transgénico vivo. Se describen además los métodos para acoplar estos experimentos para time-lapse de los nervios lesionados y control. Este paradigma experimental se puede utilizar no sólo para evaluar el papel que el juego glía en la regeneración de los nervios, pero también puede ser la plataforma para elucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la reparación del sistema nervioso.

Introducción

El pez cebra se han utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo del sistema nervioso a causa de su transparencia óptica y la facilidad de transgénesis, que cuando se combina, para permitir la proyección de imagen espectacular de los comportamientos dinámicos de células en un embrión vivo. Además, dado que el pez cebra y los mamíferos comparten casi todos los genes necesarios para la formación del sistema nervioso, la información celular y molecular recogido en este organismo modelo es directamente relacionar con otras especies de vertebrados. Aunque increíblemente poderosa para los estudios de desarrollo neural, el pez cebra y sus atributos únicos tienen el pot....

Protocolo

1. Preparación y montaje de embriones de pez cebra de Ablación e imágenes en vivo

1. Preparar un balance de 0,8% agarosa de baja fusión en el agua del huevo. Alícuota en 13X mm cultura tubos desechables 100 y se almacena a 4 ° C hasta que se necesite.
2. Adultos de pez cebra Cross contiene transgenes integrados establemente para etiquetar fluorescente neuronas motoras y tipos de células gliales de interés. Recoger los embriones de pez cebra en el agua del huevo y colocar en 28.5 ° C incubadora para una correcta estadificación posterior ^3.
3. Aproximadamente a las 24 horas después de la fecundación (HPF), eliminar el agua de huevo y añ....

Resultados

El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar la respuesta de las células gliales y otras poblaciones celulares del nervio asociadas a lesión axonal in vivo. Película 1 muestra un ejemplo de una lesión del nervio creado usando este método y la respuesta de las células gliales circundantes. Este experimento se realizó en Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) pez cebra, en el que la glía perineural expresar una membrana específica EGFP y el motor neuronas expresan citosólica Ds.......

Discusión

Los pasos más importantes de este diseño experimental son: 1) correctamente larvas de montaje para la lesión y posterior de imágenes in vivo y 2) calibrar el láser y la selección de los ajustes de potencia correctos con el fin de crear un corte transversal del nervio limpio que resulta en un daño mínimo del tejido extra- . Para ayudar a asegurar una axotomía exitoso para imágenes in vivo y análisis posterior, monte larvas múltiples, ya sea en platos individuales con fondo de cristal o en un pl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Feniltiourea	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Metanosulfonato MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
Agarosa de bajo punto de fusión	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview Placas de cultivo celular, Fondo de vidrio, Estéril, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
Placas de Petri con fondo de vidrio de un solo pocillo 35 x Willco Wells de 10 mm y 12 mm de espesor		GWSt-3512
Sistema láser MicroPoint con todos los componentes	Andor Technology - comprado a través de Quorum Technologies, Inc.	2203-SYS
MicroPoint Laser Courmarin colorante (435 nm)	Andor Technology	MP-27-435-DYE