Se describe el uso de dos, biosensores ratiometric codificados genéticamente, que se basan en la GFP, para vigilar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura vivas.
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Artículo de método
Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las mitocondrias tienen papeles en muchos procesos celulares, de metabolismo de la energía y la homeostasis del calcio para el control de la vida celular y la muerte celular programada. Estos procesos afectan y se ven afectados por el estado redox y de la producción de ATP por las mitocondrias. Aquí, se describe el uso de dos, biosensores codificados genéticamente radiométricos que pueden detectar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura viva. Estado redox mitocondrial se mide usando sensible a redox Proteína Fluorescente Verde (roGFP) que está dirigido a la matriz mitocondrial. Mito-roGFP contiene cisteínas en las posiciones 147 y 204 de la GFP, que se someten a la oxidación y reducción reversible y dependiente del entorno, que a su vez altera el espectro de excitación de la proteína. MitGO-ATeam es una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sonda en la que la subunidad ε del F o F 1-ATP sintasa se intercala entre donante y aceptor de FRET fluoproteínas rescent. La unión de ATP a los resultados de la subunidad ε en cambios de conformación en la proteína que traen el donante de FRET y aceptor en estrecha proximidad y permiten la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia del donante al aceptor.
Introducción
Las mitocondrias son organelas esenciales para la producción de ATP, la biosíntesis de aminoácidos, ácidos grasos, hemo, clusters hierro-azufre y pirimidinas. Las mitocondrias también juegan un papel fundamental en la homeostasis del calcio, y en la regulación de la apoptosis. 1 El aumento de enlaces evidencia mitocondrias a envejecimiento y relacionada con la edad las enfermedades incluyendo la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de Huntington. 2 Si bien las personas viven toda su vida con las mutaciones en las proteínas mitocondriales que están asociados con enfermedades neurodegene....
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Protocolo
1. La transformación de células de levadura con los biosensores
- Transformación de la cepa de levadura deseada con cojinete plásmido mito-roGFP o mitGO-ATeam2 utilizando el método de acetato de litio 27.
- Para confirmar la transformación con el plásmido biosensor transmitidas y para prevenir la pérdida del plásmido, seleccionar y mantener los transformantes sobre el medio completo sintético selectivo apropiado (SC-ura para Mito-roGFP, o SC-Leu para mitGo-ATeam2). Si la sonda fluorescente se ha subclonado en un plásmido diferente de los descritos aquí, usar el medio selectivo apropiado. Visualizar transformantes por microscopía de fluores....
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Resultados
Medición del estado redox mitocondrial con mito-roGFP
Aquí, mostramos que mito-roGFP1 tiene el rango dinámico para detectar cambios en el estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reducido en células de levadura viva, sin afectar el crecimiento de células de levadura o en la morfología mitocondrial. En primer lugar, nos encontramos con las células que expresan GFP mitocondrias-dirigida y roGFP1 crecen a tasas normales (Figura 1A). La máxima tasa de crecimiento, tal como.......
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Discusión
A continuación, se describen los métodos para utilizar mito-roGFP1 y mitGO-ATeam2 como biosensores para evaluar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en células de levadura viva. Encontramos que la expresión del plásmido transmitidas por Mito-roGFP1 o mitGO-ATeam resultados en orientación cuantitativa a las mitocondrias, sin ningún efecto evidente sobre la morfología o distribución mitocondrial o en las tasas de crecimiento celulares. 3 Mito-roGFP1 puede detectar cambios en el estado redox mitocondri.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por concesiones del HHMI 56006760 a JDV, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) para DMAW, y de la Fundación Médica Ellison (AG-SS-2465) y el NIH (GM45735, GM45735S1 y GM096445) a LP. GM45735S1 se emitió desde el NIH bajo la Ley de Reinversión de 2009 Recuperación y. Los microscopios utilizados para estos estudios fueron apoyados en parte por una subvención del NIH / NCI (5 P30 CA13696).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Disuelto en etanol en una solución madre de 2 mg/ml. | |
| Medio de crecimiento de levadura SGlyc (a base de glicerol sintético) *omitir para SGlyc-Ura **omitir para SGlyc-Leu | Disolver en H2O. Ajustar el pH a 5,5 con NaHCO3. Autoclave. Ingredientes: 0.67% Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos 3% Glicerol 0.05% Glucosa 2 mg/ml adenina 2 mg/ml uracilo* 1 mg/ml L-arginina 1 mg/ml L-histidina 1 mg/ml L-leucina** 3 mg/ml L-lisina 2 mg/ml L-metionina 4 mg/ml L-fenilalanina 2 mg/ml L-triptófano 3 mg/ml L-tirosina | ||
| SC (sintética completa, a base de glucosa) medio de crecimiento de levadura *omitir para SGlyc-Ura **omitir para SGlyc-Leu | Disolver en H2O. Ajustar el pH a 5,5 con NaHCO3. Autoclave. Ingredientes: 0.67% Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos 3% Glucosa 2 mg/ml adenina 2 mg/ml uracilo* 1 mg/ml L-arginina 1 mg/ml L-histidina 1 mg/ml L-leucina** 3 mg/ml L-lisina 2 mg/ml L-metionina 4 mg/ml L-fenilalanina 2 mg/ml L-triptófano 3 mg/ml L-tirosina | ||
| Valap | Combine los ingredientes en una proporción de 1:1:1 (w:w:w). Derretir sumergiendo en un 70 ° C H2O baño. Alícuota en placas de Petri de vidrio. Almacene a temperatura ambiente. Ingredientes: Vaselina vaselina, parafina dura, lanolina | ||
| Equipment and Software | |||
| Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Tamaño: 25 x 75 mm; Grosor: 0,93 a 1,05 mm |
| Cubreobjetos de alto rendimiento, n.º 1,5, 18x18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | Estos son menos variables en espesor (170± 5 y mu; m) que los cubreobjetos estándar, lo que reduce la aberración esférica y mejora el rendimiento de las imágenes 3D |
| Fisherbrand Microscopio de vidrio, n.º 1,5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Tamaño: 22 x 22 mm, n.º 1,5 de espesor (170 μ m) |
| Microscopio confocal de barrido láser A1 con detector espectral y objetivo 100x/1.49 NA Apo-TIRF | Nikon (Melville, NY) | ||
| Microscopio AxioObserver.Z1 equipado con un objetivo 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar (Zeiss) y una cámara CCD refrigerada por Orca ER (Hamamatsu) y controlado por el software Zeiss de Axiovision | (Thornwood, NY); Hamamatsu (Ciudad de Hamamatsu, Japón) | ||
| Volocity Software de análisis de imágenes 3D | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Módulo de restauración para deconvolución; Módulo de cuantificación para el cálculo y la medición de ratios | |
| Software ImageJ | Institutos Nacionales de Salud (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Referencias
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6),....
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Reimpresiones y permisos
