Enfoques Forward genéticos en<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Resumen

Se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química y la secuenciación del genoma completo. Además, un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas se describe que se puede utilizar para la cartografía genética. Este método puede ser ampliamente aplicable a los sistemas microbianos que carecen de sistemas de transformación y herramientas de genética molecular.

Resumen

Chlamydia trachomatis, el agente etiológico de las enfermedades de transmisión sexual y las infecciones oculares, sigue siendo mal caracterizado por su inflexibilidad a la transformación experimental con ADN recombinante. Hemos desarrollado un enfoque para llevar a cabo el análisis genético en C. trachomatis a pesar de la falta de herramientas de genética molecular. Nuestro método consiste en: i) la mutagénesis química para generar rápidamente amplias bibliotecas de mutantes genéticamente definidos con fenotipos distintos; ii) secuenciación del genoma completo (WGS) para asignar las lesiones genéticas subyacentes y encontrar asociaciones entre genes mutados (s) y.. un fenotipo común. iii) la generación de cepas recombinantes a través de la co-infección de células de mamíferos con bacterias mutantes y de tipo salvaje. En consecuencia, hemos sido capaces de establecer relaciones causales entre los genotipos y fenotipos. El acoplamiento de la variación genética inducida químicamente y WGS establecer asociaciones genotipo-fenotipo correlativos Should ser ampliamente aplicable a la larga lista de razones médicas y ambientalmente microorganismos importantes actualmente intratables para el análisis genético.

Introducción

La bacteria Chlamydia trachomatis cuentas intracelulares obligados para un estimado de 2,8 millones de infecciones del tracto genital por año en los Estados Unidos (Center for Disease Control) asociado con secuelas tales como la enfermedad pélvica inflamatoria, embarazo ectópico e infertilidad (1). Chlamydia spp tienen un único fisiología con un ciclo de desarrollo bifásico que consiste en dos formas: el cuerpo elemental infecciosa pero no replicante (EB) y el cuerpo reticulado no infecciosa pero replicativa (RB). La infección comienza con la unión de EBs a células epiteliales seguido de endoctyotosis (2). Dentro de una vacuola de membrana denomina ....

Protocolo

1. Mutagénesis química

Nota: Se encontró que la forma replicativa RB es más susceptible a la mutagénesis química que forma EB. A mitad del ciclo (entre 18 a 20 años hpi), RBS se encuentran en los grandes números anteriores a la transición RB-EB. Debido a Chlamydia trachomatis es un patógeno intracelular obligado, los efectos de la mutágeno sobre la salud del huésped pueden limitar la recuperación bacteriana. Se encontraron células Vero a ser más resistentes a los efectos adversos de altos niveles de ccsme que otras líneas celulares ensayadas.

La segregación de las mutaciones de recombinación requiere la....

Resultados

La exposición a mutágeno conduce a inclusiones que aparecen desprovisto de bacterias, presumiblemente debido a la muerte de la célula bacteriana. Normalmente, serovar LGV-L2 lisará completamente las células infectadas en las 48 horas de la infección, pero el tratamiento con mutágenos puede extender este ciclo para> 90 h. Se espera que aproximadamente el 10% de las inclusiones de recuperar. En nuestros experimentos, las células Vero infectadas tratadas con 20 mg / ml de SGM dirigida a una disminución de 99% en la recu.......

Discusión

Esta metodología cumple con los requisitos básicos para el análisis genético ya que establece la vinculación entre los genotipos y fenotipos. Es importante destacar que esto se logra sin la ayuda de herramientas moleculares convencionales para la transformación del ADN recombinante y la inactivación insercional de genes en bacterias, lo cual es a menudo un paso limitante de la velocidad en el análisis de la función de genes en los microbios no modelo.

Un paso fundamental es asegurar la clona.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)	Life Technologies	11995-073
Suero fetal bovino (FBS)	Cellgro	35-010-CV
Metanosulfonato de etilo (EMS)	Sigma	M0880
Ciclohexamida	Sigma	C4859-1ML
Gentamicina	Life Technologies	15750-060
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Life Technologies	14190-144
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,493 mM de MgCl2 y 0,901 mM de CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)	Life Technologies	14040-133
1 M de NaOH
5x tampón SPG (1,25 M de sacarosa, 50 mM de fosfato de sodio, 25 mM de ácido glutámico)
Tampón SPG (0,25 M de sacarosa, 10 mM de fosfato de sodio, 5 mM de ácido glutámico)
Agua (estéril, grado de cultivo de tejidos)
2x DMEM (preparado a partir de polvo, tamponado con 7,4 g/L de bicarbonato de sodio	Sigma	D7777
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Life Technologies	11140-050
1.2% GTG Agarosa , autoclave	Lonzo	50070
Kits de purificación de ADN genómico	Qiagen	69504
DNAzol	Life Technologies	10503-027
Etanol (grado de biología molecular)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanosulfónico de ácido tampón) Matraces
cultivo de tejidos de 25 cm2 (matraces T25)
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos Placas
de cultivo de tejidos de 12 pocillos Placas
de cultivo de tejidos de 96 pocillos Campana de
seguridad química Biológico
de seguridad>Centrífuga y adaptadores para placas de tejido giratorio
Microscopio
Fluorómetro (Qubit)	Invitrogen	Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrumento	Covaris

de campana>de disección