Muchas aplicaciones terapéuticas requieren un transporte seguro y eficiente de los portadores de fármacos y sus cargas a través de barreras celulares en el cuerpo. En este artículo se describe una adaptación de los métodos establecidos para evaluar la tasa y el mecanismo de transporte de nanovehículos drogas (NCS) a través de barreras celulares, tales como el tracto gastrointestinal (GI) epitelio.
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Artículo de método
Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares
En este artículo
Resumen
Resumen
Portadores Sub-micrométricas (Nanocarriers; CN) mejorar la eficacia de los medicamentos mediante la mejora de la solubilidad, estabilidad, tiempo de circulación, la orientación, y la liberación. Además, atravesar las barreras celulares en el cuerpo es crucial tanto para la administración oral de los CN terapéuticos en la circulación y el transporte de la sangre a los tejidos, donde se necesita la intervención. NC transporte a través de barreras celulares se logra mediante: (i) la ruta paracelular, a través de la interrupción transitoria de las uniones que se entrelazan las células adyacentes, o (ii) la ruta transcelular, donde los materiales son internalizados por endocitosis, transportados a través del cuerpo celular, y secretada en la superficie de la célula opuesta (transyctosis). Entrega a través de barreras celulares puede facilitarse mediante el acoplamiento de la terapéutica o de sus portadores con agentes de direccionamiento que se unen específicamente a los marcadores de la superficie celular implicadas en el transporte. Aquí, ofrecemos métodos para medir el alcance y el mecanismo de transporte de Carolina del Norte a través de una barrera de células modelo, WHICH consta de una monocapa de gastrointestinal (GI) las células epiteliales cultivadas en una membrana porosa situada en un inserto Transwell. La formación de una barrera de permeabilidad se confirmó mediante la medición de la resistencia transepitelial eléctrica (TEER), el transporte transepitelial de una sustancia de control, y la inmunotinción de las uniones estrechas. Como un ejemplo, se utilizan 200 ~ CN polímero nm, y que llevan una carga terapéutico y están recubiertos con un anticuerpo que se dirige a un determinante de la superficie celular. El anticuerpo terapéutico o de carga se marca con 125I para el rastreo de radioisótopos y los CN marcados se añaden a la cámara superior sobre la monocapa de células durante períodos variables de tiempo. NCs asociados a las células y / o transportados a la cámara subyacente puede ser detectado. Medición de free 125 I permite la sustracción de la fracción de degradado. La ruta paracelular se evalúa mediante la determinación de cambios potenciales causados por el transporte del NC para los parámetros de barrera descritas anteriormente. Transcelular i transportes determinar examinando el efecto de la modulación de la endocitosis y transcitosis vías.
Introducción
Barreras celulares en el cuerpo actúan como una puerta de enlace entre el ambiente externo y compartimentos internos. Este es el caso para el revestimiento epitelial que separa la superficie expuesta externamente del tracto gastrointestinal (GI) y el torrente sanguíneo 1-3. Barreras celulares también representan la interfaz entre el torrente sanguíneo y el parénquima y componentes celulares de los tejidos y órganos. Este es el caso para el revestimiento endotelial interior en los vasos sanguíneos, tales como la barrera sangre-de pulmón, la barrera sangre-cerebro, etc 1 La capacidad de atravesar estas barreras celulares en el cuerpo es c....
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Protocolo
1. El cultivo de una monocapa de células en Transwell inserciones
- En un nivel de bioseguridad 2 células campana de cultivo estéril, coloque 0,8 mm de poro PET Transwell inserciones en una placa de 24 pocillos (4 pozos por condición, para la significación estadística) con fórceps. Todos los materiales que entran en la campana deben ser esterilizadas con etanol.
Nota: El tamaño de poro del filtro tiene que ser seleccionado de acuerdo con el tamaño medio de la NC utilizado, para permitir el transporte a través de la membrana. Además, para obtener resultados estadísticamente significativos, cada condición experimental req....
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Resultados
Como validación de nuestro modelo celular para estudiar el transporte transepitelial de los CN dirigidos, la Figura 2 muestra que Caco-2 monocapas de células en placas a una densidad de 1,5 × 10 5 células / cm 2 alcanzado la confluencia ~ Día 12 y se mantienen la integridad de la monocapa hasta el día 18, indicado por la TEER (Figura 2A). Este fue validado por la presencia de uniones estrechas ocludina-positivo (Figura 2B) en monocapas con alta TEE.......
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Discusión
Usando los métodos discutidos más arriba, un modelo celular para el estudio de transporte de los CN dirigidos a través de barreras celulares se puede establecer, por ejemplo, el ejemplo proporcionado para Caco-2 células epiteliales, lo cual es relevante para la evaluación de transporte desde el lumen GI a la sangre en el caso de los sistemas de administración de fármacos orales. El cultivo de las monocapas de células epiteliales GI en insertos Transwell activar la medición de la TEER y fluorescencia inmunotinción de uni.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación del Instituto Médico Howard Hughes y de la Fundación Nacional de Ciencias para RG, y los fondos otorgados a SM por los Institutos Nacionales de Salud (Grant R01-HL98416) y la Asociación Americana del Corazón (Grant 09BGIA2450014).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plaquitas Transwell | BD Falcon | 353095 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pluma Estreptococo | Gibco | 15140 | |
| Células epiteliales humanas de adenocarcinoma colorrectal (Caco-2) | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Yodo | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Peligro radiactivo |
| Tampón de fosfato salino (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehído (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Inmunoglobulina G (IgG) de ratónJackson | ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Anticuerpos monoclonales de ratón contra ICAM-1 humano (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidasa, de granos de café verde | Sigma | G8507-25UN | |
| Cuentas de látex FITC, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Ácido tricloroacético (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Anticuerpo Occludin (Y-12), antihumano policlonal de cabra Santa | Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansilcadaverina (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-etil-N-isopropil) amilorida (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Contador gamma | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Voltímetro-ohmio | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Electrodos TEER | World Precision Instruments | STX100 | Electrodos disponibles para diferentes placas de pocillos |
| Dispersión dinámica de luz (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
Referencias
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-M....
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Reimpresiones y permisos
