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Artículo de método

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

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DOI:

10.3791/50646

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8 de octubre de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

Resumen

En modelos in vitro utilizando células epiteliales primarias humanas son esenciales en la comprensión de las funciones clave de la epitelio respiratorio en el contexto de infecciones microbianas o agentes inhalados. Las comparaciones directas de las células obtenidas de poblaciones enfermas nos permiten caracterizar diferentes fenotipos y diseccionar los mecanismos subyacentes que median cambios en la función de las células epiteliales. El cultivo de células epiteliales de la región traqueobronquial humano ha sido bien documentado, pero está limitada por la disponibilidad de tejido pulmonar humano o invasividad asociada con la obtención de los cepillos biopsias bronquiales. Células epiteliales nasales se obtienen a través de biopsias de raspado nasal superficiales mucho menos invasivas y los sujetos pueden hacer una biopsia varias veces sin efectos secundarios significativos. Además, la nariz es el punto de entrada para el sistema respiratorio y por lo tanto uno de los primeros sitios de estar expuestos a cualquier tipo de factor estresante transmitida por el aire, tales como agentes microbianos, contaminantes, o alérgenos.

Brevemente, las células epiteliales nasales obtenidas a partir de voluntarios humanos se expandieron en placas de cultivo de tejidos recubiertos, y luego se transfirieron a insertos de cultivo celular. Al llegar a la confluencia, las células continúan siendo cultivado en la interfase aire-líquido (ALI), durante varias semanas, lo que crea más fisiológicamente condiciones pertinentes. La condición de cultivo ALI utiliza medios definidos que conducen a un epitelio diferenciado que presenta características morfológicas y funcionales similares al epitelio nasal humano, con las células ciliadas y tanto moco produciendo. Insertos de cultivo de tejido con las células epiteliales nasales diferenciadas pueden ser manipulados en una variedad de formas dependiendo de las preguntas de investigación (tratamiento con agentes farmacológicos, la transducción con vectores lentivirales, la exposición a los gases, o la infección con agentes microbianos) y se analizaron para numerosos puntos finales diferentes que van desde vías celulares y moleculares, CH funcionalanges, morfología, etc

Los modelos in vitro de células epiteliales nasales humanas diferenciadas permitirá a los investigadores para abordar la novela y preguntas de investigación importantes mediante el uso de modelos experimentales organotypic que imitar en gran medida el epitelio nasal en vivo.

Introducción

Objetivo de la técnica

Las células epiteliales (ECS) en las vías respiratorias se encuentran entre los primeros sitios para ser expuestos directamente a los factores de estrés ambientales inhalados, tales como agentes patógenos, alérgenos o contaminantes del aire. Los CE son más que un obstáculo estructural: Actúan como un panel de control para iniciar y regular la respuesta inmune respiratoria 1-3 a través de la liberación de mediadores solubles 4-6 y la expresión de ligandos / receptores en sus superficies en 7-9. Mientras que las líneas celulares inmortalizadas pueden ser utilizados como modelos para estudiar las EC respiratoria in vitro, no logran diferenciarse en poblaciones de células heterogéneas compuestas de ciliado polarizado y células productoras de moco, similar a lo que se observa in vivo. Para recapitular características importantes de la epitelio respiratorio observado in vivo, se pueden utilizar los CE de las vías respiratorias primarias. Por lo tanto, nuestro objetivo fue optimizar nuestro método utilizando nasal ECs (CNE) obtuvo de voluntarios humanos. Los CNE se expanden y se cultivan in vitro, produciendo un modelo de cultivo celular de CNE diferenciadas que imita muchas de las características de la epitelio nasal visto in vivo.

Razón fundamental

El uso de modelos in vitro con ECs primarios humanos que imitan en la situación in vivo - como se describe en este estudio - da posibilidades únicas para estudiar la enfermedad diferencias específicas de EC, parámetros fisiológicos asociados con el epitelio de las vías respiratorias, o las interacciones entre los ECs y otros tipos de células, tales como células dendríticas 10, células asesinas naturales o macrófagos 11. Varios métodos existentes utilizan ECs bronquiales, que se pueden obtener invasiva a través de biopsias de pincel durante broncoscopias, o de tejido pulmonar descartados 12-17. Además, existen fuentes comerciales para obtener cultivos de células epiteliales de la vía aérea humana completamente diferenciadas (modelo EpiAirway de MatTek, Ashland, MA, CloneticsLonza, Basilea, Suiza, MucilAir de Epithelix Sars, Ginebra Suiza), donde los investigadores pueden elegir entre los diferentes donantes. Sin embargo, debido a la cantidad limitada de células epiteliales comercialmente disponibles, limitados o conjunto determinado de parámetros, el coste asociado a la obtención en el mercado de las vías respiratorias humanas primarias EC, y el limitado acceso a los tejidos de los pulmones descartado o recién obtenida tejido de la biopsia bronquial humano, prohíben muchos investigadores desde la realización de estudios en ECs vías respiratorias humanas completamente diferenciadas. Por lo tanto, nos propusimos desarrollar una técnica que 1) utilizan NECs humanos no invasiva obtenidos, 2) proporcionar un protocolo que permitiese culturas diferenciadas epitelio respiratorio humano, y 3) sea reproducible en la mayoría de los ajustes de laboratorio con una infraestructura de cultivo de tejido existente.

Las ventajas sobre las técnicas existentes / Modelos

La obtención de los CNE frescas, en comparación con bronquial o de la vía aérea pequeña EC, es mucho menos invasiva, individuos puede hacer una biopsia varias veces sin efectos secundarios significativos, y superficiales biopsias de raspado nasal puede llevar a cabo en las poblaciones de enfermos que de otro modo no serían elegibles para broncoscopias relacionados con la investigación. Biopsias de raspado superficial no invasivas para obtener NECs permiten al investigador para establecer la especificación de los donantes a priori, incluyendo edad, sexo, estado de la enfermedad, etc, de acuerdo con el objetivo de la investigación a realizar. Por lo tanto, en el diseño de estudios de investigación de los investigadores no están limitados por los tejidos clínicamente disponibles / muestras epiteliales, comprar costosos modelos de cultivos celulares diferenciados de los proveedores comerciales, o de diseño de los estudios de broncoscopia invasivos. Además, la facilidad para obtener los CNE aumenta la capacidad para llevar a cabo experimentos en células de diferentes donantes, lo que mejora la validación estadística de los resultados observados. Por último, la nariz es uno de los primeros sitios a ser expuestos a cualquier tipo de estrés transmitidas por el aire. Por lo tanto, la generación de organotípicos ensistemas de cultivo in vitro que imitan el epitelio nasal son útiles para el estudio de inhalación de partículas virales, contaminantes, alérgenos, o gases, que se pueden conseguir fácilmente mediante el uso de este sistema de cultivo celular.

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Protocolo

1. Preparar Plastic Ware: Escudo Plate

  1. Añadir 500 l PureCol (1:100 diluidos con agua estéril) a cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
  2. Incubar a 37 ° C en una incubadora durante 30 minutos, retirar el PureCol y enjuague con HBSS justo antes de añadir las células a la placa (véase el paso 3.1 más abajo).

2. La obtención y el tratamiento previo de la biopsia de CNE Humano

  1. Biopsia de raspado nasal
    1. Obtener ECs superficiales que recubren los cornetes nasales bajo visión directa a través de un espéculo nasal reutilizables de polipropileno 9 mm (modelo 22009) en un otoscopio operativo con espéculo (modelo 21700). Este dispositivo proporciona una visualización óptima de los cornetes nasales y flexibilidad de movimiento.
    2. Realice las biopsias con el sujeto sentado derecho en una silla de respaldo recto, con la cabeza ligeramente inclinada hacia atrás o acostado en posición supina sobre una mesa de examen.
    3. Introduzca el espéculo otoscopio en la fosa nasal y la turbi inferiornate visualizado con iluminación.
    4. Inserte una cureta termoplástico estéril a través del espéculo con la punta extendida distalmente a la parte posterior del cornete.
    5. El uso de una presión suave en la superficie inferior del cornete, la legra se dibuja a través de la superficie de la mucosa de 5x y retraído. Una recuperación exitosa de células de la mucosa en poder de la acción capilar será evidente en la copa de la cureta.
  2. Colocar la muestra en un tubo cónico de 15 ml que contiene 8 ml de RPMI 1640, el transporte en hielo.
  3. El uso de fórceps para recuperar la sonda, desalojar a los tejidos de la sonda rinoceronte con una pipeta P-1000, deseche la sonda
  4. Se centrifuga para sedimentar (4 ° C, 400 x g, 5 min), se aspira el sobrenadante (atención: cuidado de no aspirar el pellet).
  5. Resuspender el precipitado en 1 ml de BEGM con 10 l de 100x DNasa 1.
  6. Incubar a TA durante 20 min.
  7. Centrífuga (4 ° C, 400 x g, 5 min), no aspirar el sobrenadante!

3. SEED las células de plástico (día 0)

  1. Retire la PureCol de la placa y enjuague con HBSS (véase también el paso 1.2).
  2. Añadir un volumen mínimo de BEGM + Media + (80-100 mu l, hasta que aparezca un menisco de medios de comunicación en el centro del pozo) en los pozos 1-4 (dependiendo del tamaño de la biopsia) de la placa revestida.
  3. Utilizar una pipeta P-1000 para quitar cuidadosamente el sedimento del tejido de la biopsia del tubo, sin aspiración demasiado medios de comunicación.
  4. Transferir el sedimento en el medio de los pozos, mantener la biopsia juntos como un grupo de células, y no se rompen para hacer una suspensión de células individuales. A buenos rendimientos de biopsia hasta 4 pozos que pueden ser sembradas. Coloque la placa en el cultivo de tejidos incubadora (37 ° C, 5% de CO 2,> 90% humedad relativa).
  5. Compruebe después de dos horas para asegurar que hay suficiente papel (sin perturbar el menisco).
  6. Día 1, 24 horas después de la siembra: recoger todas las células no adherentes de todos los pozos (placa de inclinación y recoger los medios de comunicación con las células en un P-1000, collect todos los pocillos en un tubo de centrífuga de 1,5 ml).
  7. Centrífuga (4 ° C, 400 x g, 5 min).
  8. Mientras centrifugación suspensión de células: añadir alrededor de 250 l de BEGM + + y 250 l de mezcla de los medios de comunicación BEGM + para las células sembradas en el día 0.
  9. Repita los pasos 3.1 a 3.5 para las células no adherentes.
  10. Día 2-5: los medios de comunicación el cambio de las celdas diarias, añadir 500 medios mu l a cada pocillo, reducir la cantidad de BEGM + + gradual medios (día 2 después de la siembra: 125 l BEGM + + plus 375 l BEGM +, day3 después de la siembra y los siguientes días: 73 l BEGM + + Plus 427 l BEGM +).

4. La expansión de las células en los frascos

  1. Monitorear las células diariamente, una vez que hayan alcanzado el 80-90% de confluencia (generalmente 5-7 días después de la biopsia, si se tarda más tiempo no van a crecer con éxito) las células del elevador lo siguiente: los medios de comunicación cuidadosamente aspirados, añadir 500 l de tripsina al 0,25% por pozo, a mantenerlos a 37 º C hasta que se separan las células (por lo general toma 2-3 min).
  2. Preparar la necesidadvolumen ed de haba de la soja Inhibidor de Tripsina (SBTI) (750 l por 1 ml de tripsina) en un tubo de 15 ml.
  3. Desalojar células pipeteando repetidamente por toda la solución de tripsina; transferencia de células desprendidas en el tubo cónico de 15 ml con SBTI.
  4. Enjuague todos los pocillos con un total de 1 ml de HBSS, añadir HBSS para el tubo con las células.
  5. Se centrifuga para sedimentar (4 ° C, 400 x g, 5 min), aspirar los medios de comunicación, resuspender en 1 ml BEGM + medios de comunicación y agitar el tubo.
  6. Expandir las células en un matraz T25 o T75, dependiendo del tamaño de pellet (esto es p1; aproximadamente dos pozos confluentes entran en un frasco T75, uno confluentes bien es suficiente para un T25, por lo general 2 pozos confluentes producen una T75).
    1. Añadir BEGM + a los matraces (5 ml cada una para un T75, 3 ml cada una para un T25).
    2. Añadir la suspensión celular a los matraces. Transfiera los frascos en una incubadora de cultivo de tejidos.
  7. 24 horas después de la matraz de siembra: agregar elementos multimedia adicionales BEGM + al matraz (3 ml a un T25, 10 ml a un T75).
  8. mantener las células de los frascos: Retire el medio (aspirado desde la esquina) y añadir BEGM + medios de comunicación (5 ml/T25, 20 ml/T75). Los medios de comunicación tiene que ser cambiado cada 2-3 días. Mantener las células en el matraz hasta que son aproximadamente el 80% de confluencia (confluencia puede no ser aún lo largo de todo el matraz; normalmente esto tarda entre 7-10 días, y si no son confluentes después de 10 días no van a crecer con éxito).

5. Sembrar las células en cultivo de tejidos inserciones

  1. Retire el papel del matraz y añadir tripsina (3 ml para T25, 4 ml de matraz T75).
  2. Incubar a 37 ° C hasta que se desprenden las células (aproximadamente 2-3 minutos).
  3. Preparar SBTI (750 l por 1 ml de tripsina> 2,25 ml para T25, 3 ml para T75) en un tubo de 15 ml.
  4. Separar las células con cinta adhesiva el matraz y pipeteando arriba y abajo y transferir al tubo cónico con el SBTI.
  5. Lavar el matraz con HBSS (1 ml para T25, 2 ml para T75), añadir el HBSS para el tubo de 15 ml.
  6. Centrífugopara sedimentar (4 ° C, 400 x g, 5 min), retire el sobrenadante con cuidado.
  7. Preparar las placas: decidir cuántos platos van a ser cabeza de serie, etiquetar las placas con código de muestra y número, número de pases (es decir, p2) y la fecha. Añadir 700 mu l BEGM + medios de comunicación a la cámara basal.
  8. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio BEGM ALI por agitación del tubo.
  9. Contar las células con un hemocitómetro (un T25 normalmente produce alrededor de 4 millones de células, un T75 puede tener hasta 20 millones de células en función del islote, el uso de 1-2 million de las células de una placa de 12 pocillos) y diluir la suspensión celular con medios BEGM ALI con el volumen total necesario para la cantidad de placas que deben ser cabeza de serie (1,2 x 10 6 células en 2,5 ml de medio por placa) (Nota:. Si una parte de las células quieren congelar, etiquetar el tubo y eliminar las células aquí solemos congelamos 2 x 10 6 células en 2 ml de medio de congelación)
  10. Añadir 200 l de suspensión celular a la parte apical de cada célula Corning 12well sin revestirinsertar (> este período es de 80,000-150,000 células / inserto; 12 transwells mm con 0,4 micras de poliéster de poros (polietileno tereftalato (PET)) inserto de membrana), la transferencia en el cultivo de tejidos incubadora.
  11. Después de 24 horas, cambiar el soporte apical (200 medio de expansión l).
  12. El mantenimiento de los cultivos celulares: Cambia los medios de comunicación (medios BEGM ALI; 700 l basolateral y 200 l apical) en días alternos. Inserta tienen que mantenerse sumergido hasta que las células son totalmente confluente (sin agujeros en monocapa son visibles). Dependiendo del número de células esta toma generalmente entre 2-6 días, si se necesita más tiempo que las células lo más probable es que no sea viable.

6. Establecer Aire interfaz Liquid Una vez que las células son completamente confluentes (Cuando las células de la Transwells son completamente confluentes)

  1. Una vez que las células son completamente confluente reemplazar ambos medios apical y basolateral con medios BEGM ALI suplementado con 500 nM de ácido retinoico durante 48 horas.
  2. 48 horas después de añadir el ácido retinoico medio suplementado BEGM ALI: Preparar PneumaCult-ALI Medio de Mantenimiento (siguiendo las instrucciones del fabricante): Calcular el volumen de medio necesario (para una placa, por lo general 8,5 ml para compartimentos basales); añadir por cada 1 ml PneumaCult medio completo Base :

    10 l PneumaCult 100x Suplemento Mantenimiento
    2 l de heparina (de una solución madre 2 mg / ml)
    5 l de hidrocortisona (de una solución madre 96 l / ml).

  3. Quite todos los medios de comunicación y añadir 700 l PneumaCult-ALI medios de mantenimiento en el lado basolateral sólo (sin soporte en la parte apical).
  4. Mantener los cultivos celulares durante 4 semanas en el ALI:
    1. Cambie los medios de comunicación en días alternos (lunes, miércoles y horario Viernes funciona bien para nosotros).
    2. Después de una semana en ALI, una vez a la semana (miércoles) la superficie apical se aclara: añadir 200 l HBSS a la parte apical, mantenerlos durante 10 minutos en la incubadora, aspirar con cuidado laHBSS (utilice un 9 en pipeta de vidrio unido a la trampa de vacío en la cabina de seguridad biológica, utilizar 200 l consejos en la punta de la pipeta para succionar de la HBSS).

Nota: Cambie las puntas entre las placas, así como el cambio de las puntas cuando se pasa de la superficie apical frente basolateral. Después de aproximadamente 2 semanas en el Ali, las células comienzan a diferenciarse y aparecen cilios. Los cultivos de células alcancen una diferenciación después de 4 semanas en el ALI.

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Resultados

CNE cultivó siguiendo el protocolo aquí descrito de re-diferenciarse en una capa heterogénea de ECs compuesto de células ciliadas y no ciliadas, que representan la situación in vivo (Figura 1). Algunos de los CNE diferenciadas son moco que producen (células de la tinción de azul usando AB / PAS, Figura 1B). A pesar de que el protocolo aquí presentado está optimizado, la diferenciación puede variar con respecto a la distribución de las poblaciones de células totales

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Discusión

EC respiratorios proporcionan no sólo una barrera física para proteger el cuerpo humano de estímulos exógenos 20, sino que también actúan como un cuadro de distribución para iniciar y regular las respuestas de defensa inmune respiratorias 1-3 a través de la secreción de mediadores solubles o interacciones célula-célula directos receptor-ligando. Con el fin de estudiar más a fondo el papel de ECs en la respuesta inmune, para examinar las diferencias potenciales entre los CE de poblaciones enfermas, ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Lisa Dailey para las entradas de ayuda.

Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (ES013611 y HL095163), el asistente de vuelo del Instituto Médico de Investigación (FAMRI), y la Agencia de Protección Ambiental (CR83346301) y declara no tener conflicto de intereses. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Aunque la investigación descrita en este artículo ha sido financiado en parte por la Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU. a través de un acuerdo de cooperación con CR83346301 el Centro de Medicina Ambiental, Asma y Biología de pulmón en la Universidad de Carolina del Norte-Chapel Hill, no ha sido sometido a la del par requerido y revisión de la política y por lo tanto no refleja necesariamente la opinión de la agencia, y ningún patrocinio oficial de la agencia se debe inferir. Mencionar onombres comerciales f o productos comerciales no constituye aprobación o recomendación para su uso. Loretta Müller es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza con una donación personal.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Espéculo nasalWelch AllynModelo 220099 mm, polipropileno reutilizable
Otoscopio de funcionamientoWelch AllynModelo 21700
Cubeta de células de sonda RhinoArlington ScientificSY-96-092Doblar un poco más la cabeza de la cubeta
Placas de cultivo de 12 pocillosCorning3512
Insertos de cultivo celular de membrana TranswellCorning3460
Matraz de cultivo de tejidos Corning430639 y 430641matraz ventilado T25 y T75
Medios RPMI 1640 (con L-Glutamina)Gibco11875
Medio de crecimiento de células epiteliales bronquiales/traquealesAplicaciones celulares511-500
BEGM Medio de crecimiento de células epiteliales bronquialesLonzaCC-3170Este viene en un kit de un frasco de medio y viales con suplementos.
Solución de bicarbonato de sodio al 7,5%Gibco25080Úselo tal cual.
NuSerumBD Biosciences355104Úselo tal cual.
Medios de congelación BAMBANKERBAMBANKER302-14681Úselo tal cual.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(contenedor de congelación celular sin alcohol CryoPrep)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Bdiluido 1:100 con agua estéril (debe ser aproximadamente 0,03 mg / ml) use 500 μ l/pocillo de una placa HBSS de 12
pocillos con Ca2 y Mg2+Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25Disolver a 1,5 mg/ml, que es una solución 100x, añadir 10 μ l a cada ml de medio
Tripsina, 0,25%, 1x, con rojo fenolGibco25200-056Uso en él es
Inhibidor de tripsina de soja (SBTI)SigmaT6522Uso disuelto en HBSS a una concentración de 1 mg/ml
Ácido retinoicoSigmaR7632Hacer 100 μ M solución madre (ver más abajo), diluida a 10 μ M con alcohol absoluto, tomar 5 μ l de esto y agréguelo a 1 ml de medio BEGM (nuestra solución de trabajo).

All-trans Retinol tiene un coeficiente de extinción de 52.480 en etanol a 325 nm. Disolver 25 mg en 50 ml de etanol absoluto. Es necesario hacer diluciones en serie, diluir 50 ml de caldo en 450 ml de etanol absoluto, tomar 50 ml de este, diluir en 450 ml de etanol absoluto, tomar 50 ml de esto, diluir en 450 ml de etanol absoluto, y nuevamente tomar 50 ml de esto, diluir en 450 ml de etanol absoluto, tomar 100 ml de esto y diluir en 900 ml de etanol absoluto y leer en el espectrofotómetro a 325 nm, A continuación, este número se multiplica por su' factor de dilución, luego dividido por el coeficiente de extinción de 52,480, esto dará un número en mM. Haga un stock de 100 mM (almacene a -20 & deg; C) y a partir de este stock se hace una alícuota de 10 mM, el ácido retinoico diario necesario sería de 5 ml de esta alícuota de 10 mM en medios ALI de 995 ml. Ejemplo: la lectura de 325 nm es 1,15. 1,15 x 10.000 (factor de dilución) / 52.480 = 0,219 = 219 mM, haga un caldo de 100 mM a partir de esto, en etanol absoluto.
DMEM glucosa alta (1x), líquido, con L-glutamina y piruvato de sodioGibco11995
Extracto de hipófisis bovinaGibco13028-014Utilizado para medios BEGM ALI.
NistatinaSigmaN4014-50 mgCompuesto por una solución de 3,3 mg/ml.
Albúmina sérica bovinaFisher ScientificBP1600-100Prepare una solución de 10 mg/ml de solución en agua milliQ.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001Se presenta en forma de kit de un frasco de medio y viales con suplementos. Para obtener más información, consulte a continuación.
Hidrocortisona StemCell7904Disuelva 2,4 mg de hidrocortisona en 1 ml ddH2O (utilizado para hacer la solución madre de hidrocortisona 200x)
Sal sódica de heparina en PBS (2 mg/ml)StemCell7980Úselo es.
Matraces filtrantes (500 ml)Corning4310970,22 μ m tamaño de poro
Tubos de filtro (50 ml)MilliporeSCGP00525Steriflip, 0.22 μ Tamaño de poro m
Puntas de pipeta - ART Barrier TipsMolecular Bioproducts2139RI, 2069RI, 2179RI
Tubos cónicos, estériles, 15 ml y 50 ml
ddH2O, etanol absoluto, hielo
CO2 incubadora
centrífuga
Pipetas de cabina
(P2, P200, P1000), pipetas de vidrio de 9 pulgadas Guantes
apretados :</strong> < TD>(Esto es estable durante 2 semanas a 2-8 ° C o hasta por 6 meses a -20 ° C)
Medios y soluciones utilizados
Receta
Usado para
Observación general: siempre caliente el medio a temperatura ambiente
BEGM media
  • 500 ml de medios de aplicación de células BEGM con una alícuota de ácido retinoico
(mezclarlos por la mitad y filtrar)
  • 500 ml de medios BEGM Lonza con una alícuota de suplementos de cuota única
< >
  • digestión de la biopsia
    • BEGM+ media
    • 50 ml Medios BEGM
    • células de mantenimiento en plástico en las placas (paso0)
    • 10 μ Ácido retinoico (solución de trabajo)
    • células de siembra en el matraz (Pasaje1; parcialmente)
    • mantienen las células en el matraz
    BEGM++ media
    • 50 ml Lonza' s Medios BEGM con suplementos
    • sembrando células frescas en una placa de 12 pocillos en plástico
    • 1 ml de BiCarb
    • mantenimiento de las células en las placas de plástico (passage0; solo parcialmente)
    • 2,5 ml NuSerum
    • células de siembra en el matraz (passage1; parcialmente)
    BEGM ALI media
    • 250 ml DMEM-H
    • Mantener las células en el transpozo antes de que se conviertan en ALI
    • 250 ml BEGM que incluye suplementos
    • 2 ml Extracto de hipófisis bovina (solución de 12,5 mg/ml)
    • 1 ml de nistatina (solución de 3,3 mg/ml)
    • 75 μ l BSA (solución de 10 mg/ml)
    200X Solución madre de hidrocortisona (96 μ l/ml de solución)
    • 200 μ l hidrocortisona disuelta
    • Como complemento del medio base completo PneumaCult-ALI para el último día en el matraz y cuando las células están en insertos
    • 4250 μ l cloruro de sodio disuelto
    • 540 Μ l ddH2O
    • 10 μ l etanol absoluto< / li>< / ul> < / td> < / tr>
    Filtre la solución a través de 0.22 μ M filtre, alícuota de la solución y almacene a -20 & grados; C, evite los ciclos adicionales de congelación/descongelación
    PneumaCult-ALI Medios Base Completos
    • 450 ml PneumaCult-ALI Medio Basal
    • Medio base para los tres medios PneumaCult-ALI
    • 50 ml PneumaCult 10x Suplemento
    • Los medios PneumaCult son sensibles a la luz, por lo tanto, manténgalos siempre en la oscuridad
    PneumaCult-ALI Maintenance MediumPor 1 ml de PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:ALI cultivo en insertos
    • 10 μ l PneumaCult 100x Mantenimiento Suplemento
    • 2 μ l Heparina (de una solución madre de 2 mg/ml)
    • 5 μ l Hidrocortisona (de un 96 μ l/ml solución madre)
    refrigeradade seguridad biológica Bata de laboratorio con puños

    Referencias

    1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
    2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
    3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
    4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
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