El rastreo transsináptico se ha convertido en una poderosa herramienta para analizar las eferentes centrales que regulan objetivos periféricos a través de circuitos multisinápticos. Aquí presentamos un protocolo que explota el virus transsináptico de la pseudorrabia para identificar y localizar un circuito cerebral funcional, seguido de técnicas clásicas de rastreo de tracto para validar conexiones específicas en el circuito entre grupos de neuronas identificados.
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Artículo de método
Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado
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Resumen
Resumen
Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque ha sido utilizado más extensivamente en el cerebro mediante la utilización del virus de la pseudorrabia porcina patógenos (PRV) 1. PRV no infecta a los grandes simios, incluidos los humanos, por lo que es más comúnmente utilizado en estudios de pequeños mamíferos, especialmente roedores. El PRV152 seudorrabia cepa expresa la proteína fluorescente (EGFP) gen indicador verde mejorado y sólo cruza la sinapsis funcionales retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia desde el sitio de la infección 2,3. Otras cepas PRV tienen propiedades microbiológicas distintos y pueden ser transportados en ambas direcciones (PRV-Becker y PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo se ocupará exclusivamente de PRV152. Al entregar el virus en un lugar periférico, tales como el músculo, es posible limitar la entrada del virus en tque el cerebro a través de un conjunto específico de neuronas. El patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro a continuación, resuelve las neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Como la naturaleza distribuida de rastreo transináptico con el virus de la pseudorrabia hace interpretar conexiones específicas dentro de una red identificada difícil, presentamos un método sensible y fiable empleando aminas biotina dextrano (BDA) y la toxina del cólera subunidad B (CTB) para confirmar las conexiones entre las células identificadas utilizando PRV152. Detección inmunoquímica de BDA y CTb con peroxidasa y DAB (3, 3'-diaminobencidina) fue elegido porque son eficaces a revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 6-11.
Introducción
Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque se ha utilizado más ampliamente en el cerebro de roedores utilizando el virus de la pseudorrabia patógenos porcina (PRV), especialmente la cepa atenuada PRV-Bartha describió por primera vez en 1961 12. A continuación, presentamos un protocolo para la identificación de la representación cortical motora de los músculos específicos o grupos musculares utilizando una cepa del virus de la pseudorrabia recombinantes (PRV152) que expresa el aumento de proteína ....
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Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos con animales han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional Animal Care & Use la Universidad de Duke.
1. Almacenamiento Pseudorrabia Virus
- Obtenemos virus vivo (PRV152) desde el laboratorio del Dr. Lynn Enquist en la Universidad de Princeton en un título de 1 x 10 9 pfu / m. El protocolo para generar el virus ha sido publicada 2.
- Alícuota el virus en 20 l por tubo dentro de un gabinete de bioseguridad BSL-2 y se almacena a -80 ° C bajo condiciones de bioseguridad apropiadas.
- Descongelar una alícuota del PRV inmediatamente antes de la inyecció....
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Resultados
La tinción para eGFP debería comenzar a mostrar señales débiles en las neuronas motoras primarias, aproximadamente 72 horas después de la inyección de PRV152 en el músculo. La replicación y transporte transináptico del virus son titer- y dependiente del tiempo 4. Aproximadamente 90 horas después de la inyección, la tinción eGFP revelará potente señal en las células infectadas de orden 2 nd. Tiempos de supervivencia más largos revelarán 3º y células de orden superior, pero los tiempos de .......
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Discusión
Hay una serie de cuestiones que deben tenerse en cuenta al planificar un experimento utilizando PRV152 4,21. Lo más importante, virus de la pseudorrabia es letal. Como se mencionó anteriormente, los grandes simios, incluidos los seres humanos no son susceptibles a la infección, pero la atención adecuada deben ejercerse para proteger a otros animales. Los ratones adultos normalmente sobreviven cinco a siete días después de la inoculación con la cepa atenuada PRV152. Por lo tanto, PRV152 no es apropiado para lo.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Toshio Terashima de la Universidad de Kobe, Japón, para la enseñanza de la técnica de la cirugía laríngea, y el Dr. Lynn Enquist de la Universidad de Princeton para el suministro de PRV-Bartha. La investigación fue apoyada por Pioneer Award NIH DP1 OD000448 a Erich D. Jarvis y un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Las cifras del anterior trabajo debidamente acreditado se utilizan bajo la PLoS ONE acceso abierto licencias Creative Commons (CC-BY), de conformidad con las políticas editoriales de la revista.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo/material | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Sistema de microinyección NanoFil | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G |
| opción Marco estereotáxico | David Kopf Instruments | Modelo 900 | |
| Nanoject II Inyector de nanolitros automático | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Microtomo deslizante | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorano (Forano) | Baxter | ||
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 unidades |
| Permount Montaje Medio | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus | portaobjetos Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Aminas de dextrano biotiniladas | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Virus de la pseudorrabia | Laboratorio del Dr. Lynn Enquist (Universidad de Princeton) | PRV152 | Título >1 x 107 |
| Subunidad de la toxina B contra el cólera (cabra) | Lista de Laboratorios Biológicos | 703 | |
| Lista de subunidades de la toxina B del cólera | Laboratorios Biológicos | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidina | Sigma-Aldrich | D5905 | Tabletas de 10 mg |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 prueba |
| Formaldehído | Sigma-Aldrich | F8775 | Diluido al 4% |
| Peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamina HCl & Xilacina HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Cloruro de níquel | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Tampón de fosfato | Sigma-Aldrich | P3619 | 1,0 M; pH 7,4 |
| Solución salina tamponada con fosfato | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7,4 |
| Pentobarbital sódico | Sigma-Aldrich | P3761 | dosis |
| de 50 mg/mlSacarosa | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xilenos | Sigma-Aldrich | 534056 | Grado histológico |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (conejo); PK-6105 (cabra) | |
| Pomada oftálmica Optixcare | Vet Depot | 1017992 |
Referencias
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al.
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Reimpresiones y permisos
