Artículo de método

Ensayo Infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de SNP

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DOI:

10.3791/50683

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19 de noviembre de 2013

 ,  , 
1Arthritis and Clinical Immunology, Oklahoma Medical Research Foundation

En este artículo

Resumen

Un protocolo se describe que utiliza ensayos Infinium de Illumina para llevar a cabo la genotipificación a gran escala. Estos ensayos pueden determinar el genotipo de forma fiable a millones de SNPs a través de cientos de muestras de ADN individuales en tres días. Una vez generada, estos genotipos se pueden utilizar para comprobar las asociaciones con una variedad de diferentes enfermedades o fenotipos.

Resumen

Variantes de genotipado en el genoma humano ha demostrado ser un método eficaz para identificar asociaciones genéticas con fenotipos. La distribución de las variantes dentro de las familias o de las poblaciones puede facilitar la identificación de los factores genéticos de la enfermedad. Panel de Illumina de BeadChips genotipado permite a los investigadores determinar el genotipo de miles o millones de polimorfismos de nucleótido único (SNP) o para analizar otras variantes genómicas, como el número de copias, a través de un gran número de muestras de ADN. Estos SNPs se pueden propagar por todo el genoma o dirigidos en regiones específicas con el fin de maximizar el potencial descubrimiento. La prueba Infinium ha sido optimizado para producir alta calidad, resultados precisos de forma rápida. Con una configuración adecuada, un solo técnico puede procesar desde unos pocos cientos a más de mil muestras de ADN por semana, dependiendo del tipo de matriz. Este ensayo guía a los usuarios a través de cada paso, empezando con ADN genómico y terminando con el escaneo de la matriz. Usando Reage decoronts, ​​las muestras se amplifican, fragmentada, se precipitó, se resuspendió, se hibrida con el chip, prorrogado por una sola base, manchado, y escaneado a cada una de alta resolución del sistema óptico de imagen iScan o Hi Scan. Se requiere un paso durante la noche para amplificar el ADN. El ADN se desnaturaliza y isotérmicamente amplificado por amplificación de todo el genoma, por lo tanto, no se requiere la PCR. Las muestras se hibridan con las matrices durante una segunda etapa durante la noche. Por el tercer día, las muestras están listas para ser escaneado y analizado. El ADN amplificado puede ser almacenada en grandes cantidades, lo que permite matrices de perlas que se procesen todos los días de la semana, maximizando así el rendimiento.

Introducción

Escribiendo polimorfismos de nucleótido único (SNP) es un método clave para la identificación de variantes de riesgo asociados con la enfermedad. Históricamente, el alcance de experimentos de genotipado ha sido limitada por la tecnología disponible. Métodos de genotipificación basados ​​en la electroforesis en gel se limitan en la muestra-y SNP-producción [1]. El desarrollo de estos ensayos a menudo puede ser de trabajo intensivo, basándose en la composición y la estructura de la región que rodea la variante para la optimización de [1]. Genotipificación TaqMan, desarrollado por Life Technologies, se puede ejecutar un gran número de muestras de forma rápida y con una mínima participación técnico [2], pero las restricciones SNP-multiplexación siguen limitando el número total de los genotipos a bastante menos de un millón al día [3,4 ]. Plataforma de Sequenom IPLEX también puede ejecutar muchas muestras a la vez, pero, ya que menos de un centenar de SNPs pueden ser multiplexados juntos, el rendimiento es comparativamente bajo en general [5]. Secuencia tecnología SNP de Beckman Coulterpodría producir teóricamente más de tres millones de genotipos por día, pero este rango de proyecto límites de la tecnología a un máximo de sólo cuarenta y ocho SNPs por reacción de [4,6]. Si bien el ensayo GoldenGate puede procesar casi doscientos muestras de ADN de cada día en cientos o miles de SNPs por muestra, el precio por el genotipo no es competitivo con, técnicas de ultra-alto rendimiento avanzados al escribir más de tres mil SNPs a la vez [4,7 ]. Para procesar varios millones de genotipos por día, la escala necesaria para grandes estudios de asociación de todo el genoma, los ensayos de matriz de hibridación se han convertido en la opción más rentable en el mercado.

Línea de Affymetrix arrays de hibridación y de la línea de arrays basados ​​en Infinium de Illumina permiten potencialmente cientos de muestras que se escriben en los cientos de miles o millones de SNPs en paralelo [4,8]. Estos SNPs pueden estar dispersos por todo el genoma, localizada en las regiones de interés, como el exomes, o personalizado a la preferencia del usuario. Estas matrices tienen la ventaja de no sólo ser capaz de determinar el genotipo de forma precisa un millón de SNPs por muestra a la vez, sino también para medir el número de copias variación, anomalías cromosómicas potencialmente revelando. Alineados Infinium matrices OMNI BeadChip actualmente tienen la capacidad de determinar el genotipo de hasta casi cinco millones de marcadores por muestra, incluyendo medio de un millón de loci de encargo, en un máximo de casi un centenar de muestras de cada día.

Como la mayoría de las enfermedades tienen un componente genético, estos experimentos a gran escala puede ser crucial en la búsqueda de genes asociados con la enfermedad. Genotipado de alto rendimiento permite una generación genotipo eficiente de ejemplo establece lo suficientemente grande para detectar de manera convincente de asociación genética en las frecuencias de alelos menores inferiores. Proyectos de genotipado de todo el genoma se pueden utilizar para localizar regiones con estadísticamente significativa frecuencia de los alelos de casos y controles o las diferencias de número de copias [9,10,11]. Según el Ge humano NacionalInstituto de Investigación nome, estudios de asociación del genoma llevó a 1.490 publicaciones separadas entre el 25 de noviembre de 2008 y 25 de enero 2013, derivada del descubrimiento de 8283 SNPs con un p-valor inferior a 1 x 10 -5 (ver http:// www.genome.gov/gwastudies/). Estos estudios, que investigan las condiciones que van desde la altura con el cáncer testicular, se benefició de las líneas generales que ofrece un análisis de todo el genoma. En casos como estos, regiones enteras de interés podrían haber escapado a la atención había el alcance de la tipificación sido demasiado restrictivo. Por lo tanto, para los análisis de asociación a gran escala, una técnica de determinación del genotipo de todo el genoma es la técnica de elección.

Existen diferentes versiones del ensayo Infinium, cada uno diseñado para ser utilizado con los tipos específicos de arrays. El ensayo InfiniumUltra, discutido en profundidad más adelante, es apropiada para muchos 12 - o 24-muestra fichas de matriz. Estos a menudo genotipo más de cien mil SNPs por muestra de ADN y se centran en tregiones argeted, como en los paneles exoma o personalizados. Otras versiones de ensayo podrían ser necesarias para otros tipos de chips, tales como las matrices de genotipado de todo el genoma. Sin embargo, como todos los ensayos Infinium comparten una base común y difieren principalmente sólo por los nombres de reactivos, los volúmenes de reactivos, o el procedimiento exacto reactivo de tinción, técnicas perfeccionadas en una versión de ensayo a menudo pueden ser de aplicación universal. Otras matrices, tales como arrays de metilación, pueden utilizar un protocolo casi idéntico, también. Se debe tener cuidado al usar sólo la versión del ensayo requerida para el tipo de chip en uso. Algunos tipos, como aquellos que miden el nivel de expresión de genes, podrían requerir el uso de un protocolo nonInfinium.

Las muestras deben ser procesadas en lotes. Por ejemplo, con el ensayo InfiniumUltra, tubos de reactivo de prehibridación contienen suficiente volumen para funcionar 96 muestras, y los tubos no se pueden volver a congelar. Por lo tanto, las muestras se deben ejecutar en lotes de 96 muestras a la vez. Las muestras se amplifican en los abetost días. Después de aproximadamente 1 hora de benchwork, las muestras deben ser calentados en un horno de convección durante 20-24 h. Al día siguiente, casi 4 horas se gastará fragmentación, lo que precipitó y resuspender las muestras, momento en el que las muestras pueden o bien ser congelados para uso futuro o hibrida con el chip. Cargando fichas toma cerca de 2 horas, después de lo cual las muestras se hibridó durante la noche de 16 a 24 h. En el tercer día, la etapa de tinción y la extensión toma ~ 4 horas. Una hora más se gastará de lavado, recubrimiento, y el secado de las virutas. Finalmente, las matrices se escanean, que puede tardar 15-60 min / viruta, dependiendo del tipo utilizado.

Se aplican las medidas de seguridad de laboratorio y de limpieza estándar. Aunque la amplificación está basada en la PCR no es así, las estaciones de trabajo separadas para pre y postamplification procedimientos son necesarios con el fin de reducir al mínimo la probabilidad de contaminación. El número de identificación de cada reactivo kit suministrado en uso hay que estar inscrito en una hoja de seguimiento. Reagents deben descongelarse inmediatamente antes de su uso y de invertir varias veces antes de la dispensación. El ADN que ser escrito debe ser ADN genómico de alta calidad (260/280 relación de absorbancia de 1,6-2,0, 260/230 relación de absorbancia de por debajo de 3,0), aislado por métodos estándar y se cuantifica con un fluorómetro. La degradación de ADN es a menudo un factor que contribuye a los resultados del ensayo de baja calidad. Típicamente, se requiere 200 ng de ADN, aunque esta cantidad puede variar para algunos tipos de chips. Un robot de manejo de líquidos Tecan puede automatizar muchas de las etapas del protocolo y minimizar el error humano como factor.

Protocolo

Day One

1. Preparación

  1. Dispense 200 ng de DNA en una placa de 96 muestras de pozo profundo. Al menos 96 muestras (platos completos) deben ser plateados para asegurar que no reactivo será en vano. Etiquetar el plato con una etiqueta de código de barras suministradas por el kit y centrifugar ella.
  2. Con el fin de normalizar los volúmenes, dejar las muestras en un cajón o humos durante la noche la campana que se evapore el líquido. Cubrir la placa ligeramente con una toalla tapa o papel para evitar el polvo.

2. Amplificación

ADVERTENCIA: Las muestras no deben someterse a la amplificación a menos de 4 horas estará disponible al día siguiente para los pasos de fragmentación, de precipitación y resuspensión.

  1. Retire la caja suministrada por la empresa o el paquete de tubos etiquetados "Pre" de la -20 ° C congelador (un tubo de MA1, MA2, y MSM es suficiente para cada conjunto de 96 muestras). Establecer tubos de MA2 y MSM en el banquillo a descongelarse. Encienda correctamente calibradohorno y se puso a 37 ° C.
  2. El uso de un recipiente de los reactivos y un l 10, una pipeta de 8 canales, dispense 4 l de tampón de resuspensión de ADN en cada pocillo para rehidratar las muestras. No es necesario desechar las puntas de pipeta entre cada columna si se tiene cuidado de no tocar el líquido.
  3. Con una pipeta de 8 canales, dispensar 20 l de MA1 en cada pocillo de la placa. Para cada nuevo reactivo, use un recipiente reactivo fresco. Cubra la placa con un sello reutilizable, pulso-centrifugadora, y agitar durante 1 minuto a 1600 rpm en un agitador de microplacas.
  4. 2.4) Incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 min.
  5. Dispensar 4 l de NaOH 0,1 N a cada pocillo de la placa. Cubrir la placa con el sello reutilizable, pulso-centrifugadora, y agitar durante 1 minuto a 1.600 rpm.
  6. Se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
  7. Dispensar 34 l de MA2 en cada pocillo de la placa.
  8. Dispensar 38 l de HSH en cada pocillo de la placa. Cubrir la placa con elsello reutilizable, pulso-centrifugadora, y agitar durante 1 minuto a 1.600 rpm.
  9. Coloque en el horno durante 20-24 h.

Segundo día

3. Fragmentación

  1. Retire los tubos FMS del "Post-1" -20 ° C cuadro (un tubo es suficiente para cada conjunto de 96 muestras). Descongele en el banco o en un baño de agua a temperatura ambiente. Después de insertar el inserto MIDI-placa en un sistema de incubación micromuestra mesa, encender el bloque de calor y se puso a 37 ° C.
  2. Una vez que los tubos se descongelan, retire la placa de la muestra del horno y pulso-centrifugadora. Vierta 25 l de FMS en cada pocillo de la placa de ADN. Vuelva a colocar la tapa, pulse-centrifugadora, y agitar a 1.600 rpm durante 1 min.
  3. Incubar la placa en el bloque de calor durante 1 hora.

4. Precipitación

  1. Retire el tubo de PM1 de "Post-3" caja de 4 ° C o un paquete y se calienta a temperatura ambiente (un tubo es suficiente para cada conjunto de 96 muestras). Retire la placa de bloque de calork y el pulso-centrifugadora.
  2. Dispensar 50 l de PM1 en cada pocillo de la placa. Vuelva a colocar la tapa, pulse-centrifugadora, y agitar a 1.600 rpm durante 1 min.
  3. Incubar la placa en el bloque de calor durante 5 min.
  4. Retire la placa de bloque de calor, apáguelo, y deseche la cubierta de placas. Dispensar 155 l de isopropanol al 100% en cada pocillo de la placa. Cubra bien con una nueva tapa e invierta manualmente el plato varias veces para mezclar.
  5. Coloque la placa en 4 ° C durante un mínimo de 30 min. Encienda centrífuga refrigerada y se puso a 4 ° C hasta que se enfríe.
  6. Balance de la placa y se centrifuga a 4 ° C durante 20 min a 3000 x g.
  7. Inspeccione la parte inferior de la placa sin invertir y confirman las muestras se precipitan en una bolita azul. Si no hay gránulos se pueden ver, centrífuga de nuevo. Recibe las toallas de papel.
  8. Deseche la tapa y rápidamente eliminar el líquido invirtiendo la placa y golpearla con fuerza en la mesa de trabajo cubierta de toallas de papel. Una vez que la placa es inverted, tenga cuidado de no volver mientras queda líquido. Repetidamente toque la placa contra la mesa de trabajo hasta que se elimine todo el líquido.
  9. Coloque la placa sobre una rejilla de tubo de ensayo, invertida, que se seque. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.

5. La resuspensión

  1. Retire RA1 de "Post-2" -20 ° C y caja de deshielo en la sala de baño de agua de temperatura. Encienda el horno y ponerlo a 48 ° C.
  2. Una vez descongelado, dispensar 23 l de RA1 a cada pocillo de la placa de muestras. No vierta la botella entera de RA1 en la cuenca; ahorre 30 ml para después. Si se hibridan las muestras sobre las matrices más tarde ese día, coloque el RA1 en una C menos 4 °. Si se ejecutan las muestras en una fecha posterior, la etiqueta de la botella y vuelva a congelar el RA1.
  3. Calor-sellar una nueva tapa sobre la placa. Pulse-centrifugadora de la placa y colocar en el horno durante 1 hora.
  4. Retirar la placa del horno y agitar a 1.800 rpm durante 1 min.
    Las muestras pueden ser de forma segura held en esta etapa durante un máximo de una semana. Las placas pueden ser almacenadas, y las muestras pueden ser reorganizados para prepararse para la aplicación de chips de cuentas, si es necesario. Si continuar con el procedimiento, deje la placa a temperatura ambiente y encienda el bloque de calor. De lo contrario, guarde la placa a -20 ° C.

6. Hibridación

ADVERTENCIA: Las muestras no se someten a la hibridación a menos de 5,5 horas están disponibles el día siguiente al de la mancha y lave pasos.

  1. Encienda el bloque de calor y la puso a 95 ° C. Encienda el horno y ponerlo a 48 ° C.
  2. Una vez que la temperatura se haya estabilizado, se incuba la placa en el bloque de calor durante 20 minutos.
  3. Mientras que la placa es la desnaturalización, retire la caja de fichas de cuentas entre 4 ° C y la puso en el banquillo. Tome una botella de XC4 (del kit a temperatura ambiente) y añadir 330 ml de etanol al 100%. Agitar bien e incubar a temperatura ambiente durante la noche. Preparar la mezcla formamida / EDTA (95% de formamida, 0,2%EDTA (0,5 M), 4,8% de H2O en volumen), y congelar en incrementos separadas 15 ml. El exceso de formamida puede ser almacenada.
  4. Retire la placa de la muestra a partir del bloque de calor. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Mientras que la placa se está enfriando, preparar la cámara hyb. Se necesitará una cámara por cada cuatro fichas de cuentas procesadas.
    Coloque una estera de goma en la parte superior de la base de la cámara Hyb, alineando el orificio más gruesa con la parte frontal de la base. El símbolo de código de barras grabado en la base todavía debe ser visible (véase la Figura 2).
  6. Con una pipeta 1.000 l, dispense 400 l de PB2 en cada uno de los ocho embalses de humidificación tallados en la base. PB2 se puede encontrar en la caja o el paquete de "Post-3". Coloque la tapa de la cámara Hyb en la base y cierre ambos extremos mediante el cierre de dos cierres en lados diagonalmente opuestos primero.
  7. Eliminar los paquetes de plata individuales de chips de grano de sus respectivas cajas, pero, con el fin de minimizar la exposición de los chips 'Asegúrese de aire y luz, aún no abrirlos. Analizar cuidadosamente los códigos de barras de los chips y registrar el orden en que serán cargados en una hoja de seguimiento, junto con los ID de caja de las que provienen. Una comprensión completa de la que cada muestra de ADN individual se dispensa en los chips de talón es necesario.
  8. Retire los envases de plata individuales de los chips de cuentas de sus respectivas cajas, pero, a fin de minimizar la exposición de los chips "al aire y luz, aún no abrirlos. Analizar cuidadosamente los códigos de barras de los chips y registrar el orden en que serán cargados en una hoja de seguimiento, junto con los ID de caja de las que provienen. Una comprensión completa de la que cada muestra de ADN individual se dispensa en los chips de talón es necesario.
  9. Justo antes de los 30 min enfriamiento ha completado, abra los paquetes de chips de perlas de plata. Quite las fichas de sus fundas de plástico transparentes. Sin tocar las bolas, colocar todas las fichas del grano en un inserto de la cámara hyb, orientando el chipCódigo de barras con el símbolo de código de barras grabado en la superficie superior del inserto.
  10. Despegue y deseche la tapa de la placa de la muestra. Tomar 15 l de muestra de la placa de muestra y dispensar lentamente en la entrada a la matriz (véase la Figura 3). Debe tener cuidado de colocar la muestra correcta en el chip de cuentas correcta en la posición correcta, coincidiendo con el fin de chip de cuentas registradas a principios de la atención extraordinaria. Una pipeta multicanal puede ser utilizado para dispensar líquido sobre los chips, pero la previsión debe tener cuidado para aspirar sólo el número de muestras que se puede colocar de forma segura en el chip del grano, como el número de filas en una placa no siempre coincide con el número de filas en un chip.
  11. Una vez que todas las muestras se ha colocado en su correspondiente matriz, inspeccionar visualmente el chip de burbujas o regiones no recubiertas de líquido. Si existen estos problemas, mueva suavemente el inserto. Si es necesario, más líquido puede ser añadido a la matriz. Tenga cuidado de añadir la muestra de ADN correcta.
  12. Abra la cámara de un hybD Coloque los insertos en los embalses de humidificación. El código de barras del chip debe colocarse sobre el código de barras grabado en la base de la cámara Hyb. Vuelva a colocar la tapa de la cámara hyb y cerrar los cuatro cierres cerrando los ganchos en los lados diagonalmente opuestos primero.
  13. Incubar la cámara Hyb en el horno durante 16-24 h. Tenga cuidado de no inclinar las cámaras cuando se mueven.
  14. Si más de una placa se va a procesar, vuelva al paso 6.2. El procesamiento de más de 24 fichas de cuentas en un día no se recomienda con el fin de minimizar tanto la probabilidad de error humano al manipular una gran cantidad de artículos de consumo o las virutas y reducir al mínimo la cantidad de tiempo requerido para procesar las fichas en los pasos futuros, ya que se debe tener cuidado tomar para limitar su exposición al aire tanto como sea posible. Una botella de XC4 es suficiente para un máximo de 24 fichas de cuentas.

Día Tres

7. Preparación de tinción

  1. Retire las cámaras hyb del horno y se incuba a te habitaciónmperature durante 25 min. Si el procesamiento de más de dos cámaras hyb, escalonar su doble remoción cada 10 min. Con el fin de mantener las fichas de secado, aún no abrir las cámaras hyb.
  2. Mientras que las cámaras hyb están enfriando, retire los tubos de XC1, XC2, TEM, STM y ATM de la "Post-1" -20 ° C y caja de establecer en el banco para descongelar. Tome una botella de RA1 desde el cuadro de "Post-2" a -20 ° C (o 4 º C si la reutilización del reactivo desde el día anterior) y descongelación en un baño de agua a temperatura ambiente. Descongelar un tubo de 95% de formamida, así. Para 8 chips de cuentas procesadas, dos tubos de cada reactivo, 10 ml, 15 ml RA1 formamida, y 150 ml XC3 (que se encuentra en un cuadro suministrado por la compañía a temperatura ambiente) será requerida.
  3. Por cada chip de procesado, se requerirá que la diapositiva un vaso, una llave de paso de flujo plástico, dos cierres metálicos, y un separador de plástico. Para el separador de plástico, use solamente la clara; separar y desechar el separador opaco. Además, dos platos de lavado de cuentas de chip ySe necesitará una bandeja de fichas de cuentas, junto con una estación de montaje de líquido y una barra de montaje de plástico.
  4. Limpie las placas de vidrio rociándolos con etanol y limpiándolos seco.
  5. Encienda el baño de agua caliente que se une al bastidor cámara de flujo continuo y ponerlo a 44 ° C. Agite con cuidado el bastidor cámara para desalojar las burbujas.
  6. Cuando la cámara de Hyb se ha enfriado durante 25 min, llenar un plato de lavado con PB1 (aproximadamente 200 ml). PB1 se puede encontrar en la caja de la temperatura ambiente "Post-4".
  7. Abra una cámara hyb. Retire la junta de la tapa de un chip de cuentas agarrando el sello en una esquina y con cuidado despegando en diagonal (véase la Figura 4). Una vez que se retira el sello, colocar inmediatamente el chip en una bandeja de fichas talón y sumergirse en PB1 sin tocar las perlas. Repita hasta que la bandeja está llena de virutas de cuentas, teniendo cuidado de que no entre en seco chip.
  8. Agitar suavemente la bandeja para eliminar las burbujas y dejar las fichas sumergidos durante 1 min.Llene un segundo plato de lavado con PB1. Agitar la bandeja de nuevo.
  9. Mueve la bandeja de fichas de cuentas en el segundo plato de lavado. Agitar suavemente y dejar en remojo durante 1 min, a continuación, agitar de nuevo.
  10. En la estación de montaje de flujo continuo de líquido, colocar cuatro abrazaderas de plástico de flujo continuo negros en las ranuras. Llene la estación con PB1 hasta que el líquido casi llega a la altura de los ocho soportes de montaje (aproximadamente 150 ml).
  11. Retire un chip de cuentas de la bandeja y colóquelo en la estación de montaje de un aparato ortopédico de flujo a través del plástico. El código de barras de chip debe estar alineado encima del símbolo de código de barras grabado en la estación de montaje. Repita el procedimiento para los otros tres chips que pueden caber dentro de la estación de montaje.
  12. Coloque una clara separador de plástico en la parte superior de un chip de perlas. Los bordes exteriores del espaciador deben rodear los soportes dentro de la estación de montaje. Repita el procedimiento para los otros chips sumergidos en el PB1.
  13. Coloque la barra de montaje de plástico en la estación de montaje por su montaje en los surcos. Colocar suavemente un portaobjetos de vidrio en la parte superior del separador de plástico empujando el extremo posterior de la corredera en contra de la barra de montaje y lentamente bajar la parte delantera en el líquido. La ranura en la parte superior de la corredera debe mirar hacia abajo, directamente por encima del código de barras del chip, dejando un espacio entre el grano de la viruta y la corredera al final de código de barras. Repita el procedimiento para los otros chips sumergidos en el PB1. Para ver un diagrama completo conjunto de flujo continuo, ver Figura 5.
  14. Compruebe si hay burbujas entre el chip y el tobogán. Si aparecen burbujas, levante suavemente el portaobjetos al final del código de barras y vuelva a intentarlo. Burbujas persistentes pueden ser borrados de la copa con una toalla de papel de laboratorio (Kimwipe).
  15. Coloque dos cierres metálicos de todo el portaobjetos de vidrio, una hacia el final del código de barras y uno hacia atrás. Los bordes de los cierres debe sujetar la llave de paso de flujo de plástico bajo el chip. Repita el procedimiento para cada chip sumergido en PB1.
  16. Quite los conjuntos de flujo continuo completados y colocar en posición horizontal sobre el bench. Tenga cuidado de no inclinar el montaje en vertical, lo que permite que el líquido bajo la placa de vidrio para escapar. Si más chips están esperando en la bandeja de lavado, que se pueden montar bajo el mismo PB1. Si otros chips están esperando en sus cámaras hyb originales, desechar todo el líquido en la estación de montaje y lavar los platos, y vuelva al paso 7.6.
  17. Una vez que todas las fichas de cuentas están en sus asambleas de flujo continuo, tomar un par de tijeras quirúrgicas y cortar los dos extremos del espaciador apagado, tan cerca de la placa de vidrio como sea posible.

8. Coloración y Extensión

  1. Verifique que el estante cámara de flujo continuo ha llegado a 44 ° C en varias posiciones con una sonda de temperatura. Si la temperatura es de más de medio grado, ajuste la temperatura del baño de agua.
  2. Coloque un montaje de flujo a través de chips de cuentas en el estante cámara deslizando el ensamble hacia abajo y enganchar la abrazadera en la parte superior. El lado trasero del chip del talón debe tocar el bastidor cámara. El gdiapositiva lass debe estar mirando hacia fuera, con la ranura en la parte superior para formar un depósito de reactivo. Repita el procedimiento para cada montaje de chips de perlas.
  3. Usando una pipeta de 200 l, añadir 150 l RA1to los conjuntos de flujo a través de-por dispensar el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 30 seg. Repita 5 veces.
  4. Usando una pipeta de 1000 l, añadir 450 l XC1to los conjuntos de flujo a través de-por dispensar el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 10 min.
  5. Añadir 450 l XC2 a las asambleas de flujo continuo dispensando el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 10 min.
  6. Añadir 200 l TEM a las asambleas de flujo continuo dispensando el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 15 min.
  7. Añadir 450 l 95% mezcla de formamida / EDTA para los conjuntos de flujo a través de-por dispensar el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 1 min. Repita 1x.
  8. Se incuban las asambleas de flujo continuo durante 5 min.
  9. Ajuste el baño de agua caliente a la temperatura de lISTED en los tubos de STM (o 37 ° C si no se muestra). Asegúrese de que cada tubo STM tiene la misma temperatura que aparece.
  10. Añadir 450 l XC3 a los conjuntos dinámicos. Incubar durante 1 min. Repita 1x.
  11. Cuando la temperatura del baño de agua caliente se ha alcanzado la temperatura deseada, añadir 250 μLSTM a los ensamblados de flujo continuo dispensando el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 10 min.
  12. Añadir 450 l XC3 a las asambleas de flujo continuo dispensando el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 1 min. Repita 1x.
  13. Incubar las asambleas de flujo continuo durante 5 min.
  14. Añadir 250 l de cajero automático para las asambleas de flujo continuo dispensando el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 10 min.
  15. Añadir 450 l XC3 a las asambleas de flujo continuo dispensando el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 1 min. Repita 1x.
  16. Incubar las asambleas de flujo continuo durante 5 min.
  17. Añadir 250 l STM con el flujo a travésensamblados por dispensar el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 10 min.
  18. ADD 4 50 l XC3 a las asambleas de flujo continuo dispensando el líquido en el depósito de vidrio. Incubar durante 1 min. Repita 1x.
  19. Incubar las asambleas de flujo continuo durante 5 min.
  20. Repita los pasos 08.14 a 08.19 1x.
  21. Quite los conjuntos de flujo continuo desde el bastidor de la cámara y desconecte el baño de agua.

9. Lavado y Sellado

  1. Llenar un cordón tinción plato lavado chip con PB1 (aproximadamente 315 ml). Se necesitarán dos platos de lavado verticales y una bandeja de fichas verticales de talón, junto con al menos un colector de vacío.
  2. Desmontar una asamblea de flujo a través de la inserción de una barra de metal delgada entre los cierres y la abrazadera y luego girando. Ponga a un lado el portaobjetos de vidrio y quitar el chip de perlas. Colocar inmediatamente el chip del talón en la bandeja de fichas de cuentas vertical y sumergirse en PB1. Repita el procedimiento para todas las asambleas de flujo continuo, teniendo cuidado de enfrentar each grano de la viruta en la misma dirección y minimizar su exposición al aire.
  3. Agitar suavemente la bandeja de fichas de cuentas para eliminar las burbujas. Incubar los chips de talón sumergidas en PB1 durante 5 min. Llene el segundo plato de lavado vertical con el XC4 preparado el día anterior. Agite la bandeja de fichas de cuentas de nuevo.
  4. Mueva la bandeja de fichas de cuentas para el plato de lavado llena con XC4. Agitar suavemente la bandeja para eliminar las burbujas. Incubar durante 5 minutos y agitar de nuevo.
  5. En un solo movimiento, tire de la bandeja de fichas del talón desde el plato de lavado y fijado sobre una rejilla de tubo de ensayo, a fin de que las cuentas en todas las caras de chip de cuentas hacia arriba. Con unas pinzas de cierre automático, deslice un chip de cuentas de la bandeja y coloque en un estante de tubo de ensayo. Repita el procedimiento para cada chip de perlas.
  6. Transferir cuidadosamente la Gradilla de fichas a un desecador de vacío. Cierre y encienda el vacío, lo que garantiza un sellado adecuado. Incubar durante 50-55 min. Si es necesario, calentar el escáner durante la incubación.

10. Exploración

  1. Turn fuera el vacío y vuelva lentamente a la presión atmosférica. Compruebe que las fichas de cuentas están secos. Si es necesario, limpie los bordes y el fondo del chip con una toalla de papel para eliminar cualquier líquido o residuos.
  2. Activar el software de escaneo y moviendo las fichas de cuentas a la bandeja de exploración. Descargar archivos de decodificación del chip (DMAPS) activando el software de cliente de descodificación de archivos y la introducción de los códigos de barras de chips de cuentas deseados, junto con sus documentos de identidad de la caja correspondiente. Fichas de cuentas no escaneadas pueden ser almacenados de forma segura en un lugar oscuro y seco durante un máximo de 72 horas.
  3. Una vez los chips están colocados correctamente en la bandeja y los archivos de decodificación son reconocidos por el software, iniciar la exploración.

Resultados

Un chip de grano procesado correctamente, debe aparecer intensidades de luz láser de color rojo y de color verde brillante y distintas durante la exploración. En la figura 6, el software de exploración iScan muestra una muestra de ADN genómico estándar hibridado con éxito a una costumbre-panel de agrupación en el genotipado de SNP. Los nucleótidos marcados que fueron colocados durante las etapas de extensión y tinción fluorescente bajo las luces de los dos láseres. Como estos nucleótidos se extienden selectivamente la cadena de oligonucleótido de la perla hibridado a la cadena de ADN fragmentado, y como las cadenas de oligonucleótidos están diseñados para terminar en el sitio de la variante, el color y la intensidad de la señal resultante se puede utilizar para determinar los alelos presentes en la SNP sitio.

Una hoja generado por los usuarios de la muestra, que coincide con los ID de las muestras y la información clínica a ChipID y la posición, y un SNP manifiesto específica de la matriz, que se obtiene directamente de la compañía, son necesarios para poder importar el scaarchivos de salida Nner en el software de análisis GenomeStudio. Hojas Ejemplo de muestra se pueden encontrar en el sitio web de la compañía. Una vez que el proyecto GenomeStudio está construido, los genotipos se pueden obtener a partir de los grupos de intensidad resultantes generados automáticamente por el software. Aunque existen múltiples opciones de visualización, la vista predeterminada, Norm-R (un valor de intensidad normalizada) vs Norma-Theta (una relación de intensidad alélica), es a menudo el argumento más fácil de diferenciar tres grupos distintos. La mayoría de los SNPs deben mostrar uno, dos, o tres grupos, dependiendo de la frecuencia del alelo menor.

Los tres grupos representan muestras que demuestran AA, AB, BB o alelos (véase la Figura 7). Estos grupos se pueden asignar genotipos, ya sea mediante la importación de una plantilla de la posición estándar de la agrupación directamente de la empresa, mediante la selección de "Cluster Todos SNPs" de la barra de herramientas de análisis del software, o haciendo clic y arrastrando los círculos de colores en las parcelas intensidad para edi manualmente t llama. El color de la muestra en el gráfico de intensidad (rojo, púrpura o azul) indica que la llamada (AA, AB, BB o, respectivamente); negro indica que no hay llamada. Al desplazarse por los SNPs que figuran en el panel de datos completa del software, la agrupación para cada SNP puede ser visto o recordado. Una vez que los grupos se asignan las llamadas satisfactorias, el panel de datos completa del software enumera los genotipos para cada muestra individual en cada SNP particular. La opción Selector de columnas por encima de la tabla puede cambiar los formatos de datos.

Los datos pueden ser exportados, ya sea a través de la barra de herramientas de análisis o directamente de la tabla completa de datos para un análisis en profundidad.

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Figura 1. Información general - Protocolo de ensayo Infinium.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Figura 2. Complete Chamber Hyb base y colchón, y tapa. [12] Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 3 Carga de un BeadChip -.. Dispense la muestra en los puertos de entrada [12] Haga clic aquí para ver más grande imagen.

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Figura 4 Extracción de la BeadChip Coverseal -.. Sujete el sello en la esquina y quitar con cuidado en diagonal [12] Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 5. Conjunto completo BeadChip Flow-through - El BeadChip se separa de un portaobjetos de vidrio con un espaciador y ató con broches.> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Figura 6. Exitosa BeadChip Scan - A) El BeadChip se escanea con tanto un láser rojo y verde, el software de escaneo muestra tanto de forma simultánea. Secciones pasan QC intensidad destacarán verde en la pantalla BeadChip a la izquierda. Secciones defecto QC intensidad se destacan rojo en la pantalla BeadChip. B) Una vez finalizado el escaneo, el software se superpondrá a las pantallas de color rojo y verde. Se muestra una imagen con zoom-in. El color y la intensidad de cada grano individual indica el alelo presente. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 7. SNP NORMA-R vs Perfiles del clúster NORM-THETA - A) Un SNP es válido con tres grupos distintos que representan a AA, AB, BB y genotipos, de color rojo, púrpura y azul B) Una edición que requiere SNP.. El grupo medio, que debe ser homocigotos AB, se deja llamado-un. El cluster BB está equivocadamente llamado AB. C) Una de bajo rendimiento SNP. No hay genotipos se pueden obtener de esta parcela intensidad, ya que no existen grupos distintos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Discusión

Aplicaciones de genotipado a gran escala se han utilizado para comprender mejor el mecanismo genético subyacente en muchas enfermedades humanas. El descubrimiento de cualquier variante significativa a través de un análisis de asociación amplia del genoma puede destacar una región candidata para el estudio adicional. Además, los datos genotipo es una buena herramienta para el control de calidad en los proyectos de secuenciación.

Para maximizar el rendimiento de la muestra, múltiples placas de muestra se pueden amplificar y almacenados en sus estados fragmentados, resuspendido. Ocho placas pueden ser amplificados en un solo día, la combinación de las primeras 24 h del protocolo para varios lotes y proporcionar material suficiente para ~ 2-8 días de procesamiento de chip. Si las placas amplificados se almacenan de antemano, y si las nuevas muestras se hibridan a los chips inmediatamente después de la exploración comienza en la ejecución anterior, el procesamiento puede funcionar continuamente sin la necesidad de hacer una pausa para la preparación de la muestra adicional. Por lo tanto, aunque las muestras tendrán tres días para someterse a la completaensayo, los datos se pueden generar todos los días. Fichas Assuming24 se procesan cada día, una semana laboral de 5 días permite más de un 1.000 muestras de ADN para que se ejecuten en un chip de talón 12 muestras. Si cualquier paso o reactivo no ha logrado, sin embargo, varios lotes podrían estar en riesgo de malos resultados antes de cualquier corrección se puede aplicar. Los errores pueden pasar desapercibidos hasta que los arrays se escanean o analizados, por lo tanto, si el rendimiento se maximiza, cientos de muestras en diferentes etapas del protocolo pueden ya han recibido el mismo tratamiento defectuoso sobre el descubrimiento. Como reactivos y la pérdida de datos no se pueden recuperar, el usuario debe sopesar estos riesgos contra la necesidad de un flujo de trabajo acelerado.

El software de análisis de GenomeStudio es la primera oportunidad de medir realmente el éxito del proceso de determinación del genotipo. Si la norma-R vs parcelas intensidad Norma-Theta están debidamente agrupados, la tasa media de las llamadas (por ciento del total de SNPs escrito correctamente) de las muestras debe acercarse a 99%, aunque este valor varía slightly dependiendo del tipo de matriz. Los datos de cualquier muestra con una tarifa de llamadas inferiores a 85-90%, no es digno de confianza y deben desecharse. A efectos de control de calidad, los resultados deben ser comparados con ningún genotipos siempre que sea posible previamente conocidos. Si no existe tal información, intencional duplicación de la muestra es una herramienta útil en la verificación de la placa o de matriz colocaciones. Estos pares de duplicados se deben colocar en chips separados, placas, lotes o proyectos; sus genotipos comprueban tras generación. Si bien las limitaciones de CC específicos varían de acuerdo a la preferencia del investigador, las limitaciones SNP comunes se basan en el éxito llamada de ejemplo, Hardy-Weinberg o missingness entre casos y controles, mientras que las restricciones de muestra comunes se basan en las tarifas de llamadas, incoherencias mendelianos, o las referencias cruzadas del cromosoma X heterocigosidad a los datos clínicos de género [13].

Si surge algún problema, el Dashboard controles, que se encuentra en la sala de análisis, puede ser sometido a laempresa con el fin de determinar la causa. Estos controles a menudo pueden reducir la cuestión a la etapa más probable o el fracaso de reactivos. Si alguno de los SNPs de interés se encuentran a través de un experimento de genotipado Infinium, sus parcelas intensidad debe ser una doble comprobación en GenomeStudio por errores de agrupación antes de que se realicen más investigaciones.

Un fallido Infinium experimento de genotipado es probablemente debido a un error de procesamiento humano o ADN de entrada de baja calidad. Ejemplo de cuantificación debe ser exacta y precisa. Para obtener los mejores resultados, ningún reactivo añadido a cualquier muestra o chip deben ser dispensadas en el volumen establecido por el protocolo. Las pipetas se calibran correctamente. Los reactivos no deben ejecutarse después de la caducidad y no deben volver a congelarse una vez descongelado, salvo para el reactivo RA1. Con el fin de minimizar los posibles errores de tinción y extensión, la mezcla formamida / EDTA debe estar preparado fresco cada mes. Todos los -20 ° C, los reactivos deben almacenarse en sólo congeladores de descongelación manual. Todo el material de laboratorio utilizado en la víaaining, de extensión y de lavado de partes del protocolo se deben enjuagar bien con agua y detergente suave inmediatamente después de dejar de usar. Los depósitos en la cámara de humidificación hyb se deben lavar con un cepillo de tubo de ensayo y un detergente suave. Las placas de vidrio se deben lavar con lejía al 10%, según las instrucciones de sus manuales de usuario, una vez a la semana.

Divulgaciones

Los autores de este artículo no tienen intereses financieros en competencia a revelar.

Agradecimientos

La financiación de este trabajo ha sido proporcionada por NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 y NIH R56 AI063274

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Consumible o equipo>Fabricante>Número de piezaMínimo requerido para 96 muestras
0,8 ml Placa de pocillo profundoThermo ScientificAB-0765 1 Plancha Thermo Scientific AB-0674
2
Cuenca de reactivosFisher Scientific13-681-5029
Hojas termoselladasThermo ScientificAB-05591
Espaciador de flujocontinuo Fisher ScientificNC95639846
Puntas de pipeta - 200 μ lRaininGP-L200F192
Puntas de pipeta - 10 μ lRaininGP-L10F16
puntas de pipeta - 1.000 μ lRaininGP-L1000F16
Tampón de suspensión de ADNTeknovaT02200,5 ml
0,1 N NaOHFisher ScientificAC12419-00100,5 ml
Isopropanol (grado HPLC)Fisher ScientificA45115 ml
Etanol (200 grados)Sigma-Aldrich459836330 ml
Formamida (100%)Thomas ScientificC001K3815 ml
EDTA (0,5 M)AmrescoE1770,2 ml
10 μ l Pipeta de 8 canalesRaininL8-10XLS1
200 μ l Pipeta de 8 canalesRaininL8-200XLS2
1.000 μ l Pipeta monocanalRaininL-1000XLS1
Agitador de microplacasVWR13500-8901
Centrífuga de microplacas refrigeradaVWRBK3694341
Horno de hibridaciónIlluminaSE-901-10011
Incubadora de micromuestras HybexSciGene1057-30-01
Insertode bloque de calor Hybex MIDIIlluminaBD-60-6011
TermoselladorThermo ScientificAB-03841
Cámara Hyb con inserto y tapeteIlluminaBD-60-4022
Tijeras quirúrgicasFisher Scientific13-804-201
Flujo a través de piezas de ensamblajeIlluminaWG-10-2028
Rejilla de lavado y platoIlluminaBD-60-4501
cámara GenepaintTecan760-8001
Sonda de temperaturaIlluminaA1-99-1091
Gradilla de tinción y platoIlluminaWG-10-2071
Pinzas de cierre automáticoTed Pella, Inc5374-NM1
Colector de vacíoTed Pella, Inc22401
iScan o HiScanillumina- 1
Portaplatos y gradilla de

Referencias

  1. Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).
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  13. Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).

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